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发表期刊：Molecular Neurobiology
发表时间：12 July 2024
观点提炼：
1.缺血性卒中是全球范围内认知障碍的一个突出病因
2.神经生长因子（NGF）在穿过血脑屏障（BBB）时对基底前脑胆碱能神经元（BFCN）产生主要作用。
3.NGF在促进BFCN的生长、修复和存活方面起着至关重要的作用，从而减轻对胆碱能系统的损害并最大限度地减少其后果。
4.通过激活p65-VEGFA-TJs通路，SMES有效地打开大鼠的BBB并促进NGF转运到海马体。
5.这一发现提供了创新证据，支持大分子治疗药物治疗中枢神经系统疾病的潜力。
缺血性卒中是全球范围内认知障碍的一个突出病因。卒中后认知障碍（PSCI）包括一系列满足卒中事件后6个月内发生的认知障碍诊断标准的综合征。该定义强调了中风和认知障碍之间潜在因果关系的重要性，以及临床管理与认知能力下降之间的相互关系。PSCI研究结果的出现将其推向了当代国际卒中研究和干预的前沿。认知障碍通常是中风的普遍后果，给患者、家庭和社会带来沉重的负担。研究表明，缺血性中风通过内质网应激、氧化应激和炎症反应的机制引起胆碱能神经元损伤。胆碱能系统采用乙酰胆碱作为神经递质，与记忆和选择性注意等认知过程密切相关。因此，胆碱能途径和神经系统容易受到血管损伤，最终导致PSCI。当前神经康复研究的一个重要重点领域是围绕设计加速NGF向脑组织的运输的方法，从而在血液中实现有效的药物浓度，从而促进其参与增强神经营养和皮质可塑性。我们研究了SMES诱导的NGF递送对MCAO/R大鼠长期记忆增强和胆碱能神经元保存的影响，以阐明SMES促进NGF转运到大脑的机制。SMES诱导的BBB通透性的潜在途径涉及p65-VEGFA-TJs通路。这一发现为使用大分子治疗剂治疗中枢神经系统疾病提供了新的见解。
实验框架。实验1：该研究将大鼠分为对照组和MCAO/R组，以测试建模后的记忆障碍。对照组未接受干预，而MCAO/R组使用缝合法建模，并在28天后通过水迷宫或物体识别实验进行测试。实验2：本研究将MCAO/R大鼠分为不同组，以正常大鼠为对照，测试了持续治疗效果。治疗后进行水迷宫实验6d，然后检测IF、IHC和TEM。实验3：将MCAO/R大鼠分为不同组进行ELISA检测，以验证SMES在各个脑区mNGF的通透性。将另一组MCAO/R大鼠分为几组，对p65-VEGFA-TJs信号轴进行WB和ICH验证，探讨SMES对海马BBB开放的影响在调查建模后潜在记忆障碍的研究中，大鼠分为对照组和MCAO/R组。对照组大鼠未接受干预。建模后28天使用MWM或NOR实验进行记忆评估。在旨在确认持续治疗效果的研究中，将MCAO/R大鼠随机分为MCAO/R组、NGF组、SMES组和NGF+SMES组4组，正常大鼠作为对照组。干预后，进行了为期6天的水迷宫任务，然后评估了IF、IHC和TEM分析。为评估SMES对mNGF在MCAO/R大鼠各脑区的通透性，将MCAO/R大鼠随机分为MCAO/R组、NGF组、NGF+PDTC+SMES组和NGF+SMES组进行ELISA，探讨p65-VEGFA-TJs信号通路对SMES诱导的MCAO/R大鼠海马BBB打开以促进mNGF进入大脑的影响。因此，将MCAO/R大鼠随机分为MCAO/R组、PDTC+SMES组和SMES组，用于信号通路蛋白的WB和ICH验证。在我们之前的实验中，我们观察到SMES有可能增强mNGF对大鼠额叶的渗透。然而，mNGF渗透到不同认知相关大脑区域的程度仍然未知。我们测量并比较了三组正常大鼠认知相关脑区的mNGF通透性和特异性通透性，以验证这些影响在大鼠中的作用。因此，SMES促进了初级运动皮层（M1）和除前额叶（PrL）以外的各种认知相关大脑区域mNGF的上调（图阿拉伯数字A-F）。在海马体中观察到mNGF水平显着增加（图.阿拉伯数字G).通过ELISA测量的M1和各种认知相关脑区mNGF表达的蛋白质。A、B、C、D、E、F除PrL和MS外，NGF+SMES组效果显著。结果证明为SEM±平均值（n=5，每组）。*P<0.05，**P<0.01，P<0.001，P<0.0001与NGF+SMES组。G对海马有显著影响。结果被证明为SEM±平均值（n=5，每组）。**P<0.01，P<0.001，P<0.0001与海马组。a、b、c、d、e、f与MCAO/R组、NGF组或NGF+SMES+PDTC组相比，NGF+SMES组在M1、脑干和海马中具有显著的渗透作用。结果证明为SEM±平均值（n=5或8，每组）。*P<0.05，**P<0.01，P<0.0001与NGF+SMES组。g海马体有显着影响。结果证明为SEM±平均值（n=6，每组）。P<0.0001vs.海马组鉴于SMES在海马体中的良好性能，我们使用ELISA评估mNGF在三组MCAO/R大鼠受影响半球的通透性。正如预期的那样，NGF+SMES组在MCAO/R后28天升高（图D）。2a、b、c、d、e、f）。这些发现表明，SMES可能会加速mNGF通过BBB的传播，尤其是向海马体的传播。我们进行了NOR测试和MWM测试，以评估MCAO/R28天后大鼠的认知功能（图D）。3A，B）。MCAO/R后28只大鼠的空间认知能力无显著变化，兴奋性无明显异常（图D）。3C）.旷场分析中的中心网格停留时间反映了空间认知能力，各组间无显著差异（图D）。3C1）。动物旷场分析中粪便颗粒的数量反映了动物紧张的程度（图D）。粪便颗粒的数量越多，张力越高。对照组粪便颗粒数显著高于MCAO/R组。MCAO/R后28天大鼠的张力降低。在NOR的短期记忆和长期记忆测试中，组、时间、组和时间/组交互作用的主效应不显著（图D）。3D-E2）。NOR实验表明，两组大鼠的长期记忆和短期记忆没有显著差异，因为新物体识别归因于额叶损伤，间接证明MCAO/R28大鼠的额叶没有受损（图D）。3D-E2）。接下来，我们进行了水迷宫测试。在治疗前的水迷宫试验中，组、时间、组、时间/组交互作用的主效应均具有显著效果（图D）。3F）.对照组在5天的实验中表现出较强的学习能力，逃逸潜伏期逐渐缩短。虽然MCAO/R组在第3天和第4天的逃逸潜伏期较第一天有所改善，但最后一天的逃逸潜伏期更长（图D）。3F）.在第6天移除平台后，对照组的大鼠在导航到目标象限时表现出优越的学习偏差。与MCAO/R组相比，他们显示出更多的目标象限停留时间和目标象限中平台交叉的频率增加（图D）。3F1、F2）。我们的结果显示，MCAO/R后28d大鼠的空间学习和记忆仍然受损，因为MWM是海马最敏感的检测指标，SMES打开海马BBB的意义。因此，在下一个实验中，我们专注于通过治疗改善海马体。28天的MCAO/R建模仍然导致大鼠的空间学习能力和长期记忆受损。A新的对象识别实验（NOR）测试干预图。B在训练期间，将A1和A2对象放入盒子中，并在1小时或24小时后用B对象替换A2。C、C1、C2习惯化期间行进的距离、中心时间和排便颗粒的数量。D、D1、D2和E、E1、E2NOR测试结果的典型迹线和热图;A1和A2的探索时间以及识别指数代表了两组的识别记忆。F、F1、F2两组5个训练日的莫里斯水迷宫（MWM）测试中的逃逸潜伏期。MWM测试中第6天（探测）期间目标象限中花费的时间和条目数。结果证明为SEM±平均值（n=7，每组）。**与第一天相比，P<0.01，P<0.001，P<0.0001（图3）
本研究旨在检验空间学习和记忆对依赖于海马加工的短期记忆任务的影响。在测试之前，我们进行了连续治疗（图D）。1实验2）。重复测量双向方差分析表明，各组的学习曲线不同，主要影响是日因素（图D）。4A）.研究结果表明，在训练期间定位隐藏平台时，SMES+NGF组大鼠表现出逃逸潜伏期和路径长度减少，表明在连续SMES+NGF治疗后，它们的学习能力有所增强。相比之下，其他组中的大鼠在延迟或路径长度方面没有表现出任何显着的减少（图D）。4A、C-G）。在任何实验组中，游泳速度都没有显着变化（图D）。4值得注意的是，在第六天，NGF+SMES组的大鼠在向目标象限的导航中表现出优异的学习偏倚。与MCAO/R组相比，他们表现出时间和行驶距离减少，并在目标象限内穿越平台的频率增加（图D）。4H-J）。特定模式电针刺激将mNGF输送到大脑中，改善了大鼠的空间学习能力和长期记忆。A不同组5个训练日的MWM测试中的逃逸潜伏期和B游泳速度（C、D、E、F、G）。结果被证明为SEM±平均值（n=9，每组）。*与第一天相比，P<0.05，**P<0.01，P<0.001，P<0.0001。HMWM测试中第六天（探测）在目标象限中花费的时间和I次平台穿越次数。J建模后观察大鼠的游泳路径，并在第5天（学习）和第6天（记忆）的水迷宫测试中为NGF+SMES组捕捉代表性图像。在第6天删除的平台由虚线表示。结果被证明为SEM±平均值（n=9，每组）。*P<0.05vs.MCAO/R组（图4）
SMES介导的mNGF减少海马胆碱能神经元凋亡和线粒体自噬已观察到SMES和NGF的结合可减少MCAO/R后海马细胞凋亡和线粒体自噬。在每组内的各个海马区域检测到TUNEL阳性细胞，在对照组和SMES+NGF组中观察到细胞凋亡发生率较低。相反，其余组表现出比对照组和SMES+NGF组更多的凋亡细胞，表明SMES和NGF的组合有效减轻了海马体内的细胞凋亡（图D）。5A-D1）。各组海马不同部位TUNEL细胞的表达和治疗后CA1区的线粒体状态。建模后28天，A、B、C、DTUNEL染色的凋亡细胞仍然存在于海马的各个分区中，但SMES+NGF组表达较少;比例尺为20μm。A1、B1、C1、D1大鼠MCAO/R后海马体中TUNEL阳性细胞数除以DAPI染色细胞比率的免疫组织化学分析。EMCAO/R和NGF组神经元周围的线粒体表现出损伤，其特征是嵴结构异常和液泡的存在。相反，其余组中的线粒体没有表现出显着的损伤。SEM±平均值（n=4）。显著水平：P<0.0001vs.对照组，&&&P<0.0001vs.SMES+NGF组（图5）
海马CA1区线粒体检查显示线粒体正常，对照组、SMES组和SMES+NGF组线粒体正常，呈完整的双膜，嵴清晰。然而，MCAO/R和NGF组中的大多数线粒体表现出异常的嵴结构，许多肿胀的线粒体包含许多未连接到外腔的小泡状嵴。因此，这导致线粒体嵴的结构紊乱、空白区域的出现以及线粒体外膜的退化（图D）。5E).
SMES和NGF增加了梗死海马中胆碱能神经元的数量
MCAO/R后测定海马4个部位ChAT阳性细胞的表达水平，进一步探讨各组ChAT阳性细胞蛋白表达的变化。对ChAT进行免疫组织化学分析，以检查MCAO/R及其治疗是否调节胆碱能神经元中的蛋白质表达。
如图1所示。6A，免疫组化分析显示，SMES+NGF组海马CA1区ChAT阳性细胞的蛋白表达显著高于MCAO/R、NGF和SMES组（P<0.01;无花果。6在海马CA2区域，各组之间没有显着差异（图D）。6C）.在海马CA3区，SMES+NGF组，与MCAO/R组相比，ChAT阳性细胞的数量显著增加（P<0.05;无花果。6在海马DG区，SME+NGF和NGF组与MCAO/R组相比，ChAT阳性细胞数量显著增加（P<0.05;无花果。6E).
大鼠治疗后海马不同部位ChAT阳性细胞数量的表达。A大鼠海马ChAT阳性细胞及其MCAO/R后各分区的代表性免疫组织化学图像。B、C、D、E大鼠缺血顶叶皮层海马免疫组化分析后缺血顶叶皮层海马ChAT阳性细胞数。SEM±均值（n=5）。显著水平：*P<0.05，**P<0.01，P<0.001vs.MCAO/R组和##P<0.01vs.NGF组（图6）
对照组和SMES+NGF组海马中的胆碱能神经元排列规则，层清晰。MCAO/R、NGF和SMES组神经元排列不规则，细胞间隙大于正常组和SMES+NGF组，少数神经元失去结构完整性。SMES可促进p65-VEGFA-TJs信号通路激活研究表明，VEGFA可诱导脑微血管内皮细胞的激活，而已建立的NF-κB/MMP-9轴可诱导VEGF释放。这些发现意味着NF-κB信号通路的激活促进了血管生成和神经发生，因此有必要进一步研究VEGFA在紧密连接上的下调。我们进行了抑制剂组的实验（图D）。1实验3）。我们观察到SMES处理导致海马p-p65的激活，导致VEGFA蛋白的下游调节，随后BBB中TJ表达的降低。采用免疫组化验证磷酸化NF-κB和VEGFA表达。进行了比较分析，包括多个组。图1中描述的发现。7A、B和B1表明，与MCAO/R组和SMES+PDTC组相比，SMES组在处理后表现出显著更高的阳性细胞数量，表明SMES具有增强核NF-κB表达和细胞质VEGFA表达的潜力。SMES改变了海马中p-p65、VEGFA和TJs的表达。许多VEGFA阳性细胞和NF-κB核染色以棕色显示。比例尺，50μm。B，B1免疫组化结果的定量;n=4个。C各组梗死侧海马NF-κB、p-p65、VEGFA、occludin和ZO-1表达的Westernblot分析。蛋白质印迹结果的D、D1、D2、D3定量，左图显示归一化为β-肌动蛋白的汇总蛋白质表达;n=8个。*P<0.05，**P<0.01，P<0.001，P<0.0001vs.SMES组，#P<0.05vs.MCAO/R组，单因素方差分析，然后是Bonferroni事后检验（图7）
通过WB分析评估各实验组梗死侧海马中NF-κB、p-p65、VEGFA、occludin和ZO-1的水平。这些发现表明，SMES诱导磷酸化p65的激活并增加VEGF-A表达，从而降低occludin和ZO-1的表达，它们是紧密连接蛋白的关键成分（图D）。7C-D3）。缺血性卒中是全球范围内认知障碍的一个主要病因，主要归因于大量胆碱能神经元的凋亡。遗憾的是，由于其固有的生物毒性、严重的不良反应和有限的疗效，许多神经保护剂已被证明无效。在这项调查中，即使在MCAO/R后28天后，受影响半球海马神经元的改变仍然很明显。这项研究揭示了患侧海马体内胆碱能神经元的数量减少，伴随着线粒体自噬和细胞凋亡的增加，最终导致大鼠的空间学习和记忆受损。我们的治疗有可能缓解这些情况。具体来说，SMES促进p65-VEGFA-TJs通路的激活，从而显着增加MCAO/R大鼠海马中外源性NGF的水平。将NGF引入大脑增强了MCAO/R大鼠的海马突触可塑性。此外，SMES有效地打开BBB，而不会对海马胆碱能神经元、线粒体完整性或自噬产生不利影响。
中枢胆碱能系统与学习和记忆密切相关。乙酰胆碱（Ach）是中枢胆碱能系统中的重要神经递质，包括乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BChE）。胆碱（Ch）和乙酸盐合成ChAT，ChAT在囊泡乙酰胆碱转运蛋白（VAChT）的作用下储存在囊泡中（图D）。8）。它的主要功能是维持意识，并在注意力、学习和记忆中发挥重要作用。它是大脑中的主要神经递质。BFCN是NGF进入大脑后的主要靶细胞。NGF可以促进BFCN的生长、修复和存活。NGF可以减少对胆碱能系统的损害和受伤后的影响。在正常大脑中，这些神经营养因子由基底前脑胆碱能投射的皮质靶细胞产生，并在胆碱能细胞体区域局部产生。因此，神经营养因子的可用性，无论是在轴突末端区域还是细胞体区域，都可能有助于胆碱能系统的发育和维持，也可能有助于其损伤后的恢复。
说明了神经递质乙酰胆碱合成、释放和再摄取的关键步骤
（图8）
我们之前的研究发现，SMES作用于水沟和百惠可以打开正常大鼠的BBB。SMES促进的BBB开放不会导致脑水肿、神经胶质细胞活化或细胞凋亡。研究还证实，电针可以通过增加脑血流量并通过SMES激活脑组织中的皮质神经元来诱导大鼠BBB开放。研究表明，脑微血管内皮细胞中NF-κB的磷酸化导致紧密连接蛋白occludin和ZO-1的表达降低。此外，研究表明，脑微血管内皮细胞上VEGFA的激活可以减轻脑缺血/再灌注损伤。此外，经典的NF-κB/MMP-9轴可以刺激VEGF的释放。这些发现表明，NF-κB信号通路的激活促进了血管生成和神经发生，并且在紧密连接上下调了VEGFA值得进一步研究。我们的实验结果表明，在修复脑缺血过程中，脑微血管内皮细胞中NF-κB磷酸化的激活导致VEGFA表达上调。因此，这降低了紧密连接蛋白的表达，导致海马BBB打开并促进NGF进入大脑。在未来的研究中，必须更深入地研究SMES对脑缺血性损伤的影响，不仅包括神经再生，还包括神经发育、轴突可塑性和脑血管修复。最近的研究表明，缺血性中风可以在恢复阶段减少大鼠海马体内胆碱能神经元的数量，并影响空间学习和记忆。SMES促进M1和各种认知相关大脑区域（PrL除外）中mNGF的上调。通过激活p65-VEGFA-TJs通路，SMES有效地打开大鼠的BBB并促进NGF转运到海马体。给药后，SMES表现出大鼠空间学习和记忆增强的，同时增加了海马体内胆碱能神经元的数量。这一发现提供了创新证据，支持大分子治疗药物治疗中枢神经系统疾病的潜力。
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