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内容提要
本文报道了“一体化”光疗纳米颗粒(TSD NPs)具有平衡的活性氧和光热转化能力，可用于光免疫和ICB免疫联合治疗OSCC。引入一种新型电子受体3-(二氨基乙烯)2,3-二氢苯并噻吩-1,1-二氧化二氢苯并噻吩(DTM)，制备了具有聚集诱导发射(AIE)特征和NIR-II荧光中心为1000 nm的光治疗剂。TSD NPs还表现出强的I型活性氧(ROS)生成和高光热转化效率(45.3%)，可深刻诱导免疫原性细胞死亡(ICD)，激活细胞毒性T淋巴细胞，将免疫抑制的肿瘤微环境转化为免疫支持的微环境。此外，TSD NPs上调了OSCC细胞上PD-L1的表达，从而增强了与PD-L1 ICB免疫疗法联合治疗的疗效。![]()
TD和TSD的设计与表征
本文采用杂环基团(3(二氨基乙烯)−2,3-二氢苯并噻吩-1,1-二氧化二苯并噻吩，DTM)作为新的吸电子单元来设计高效的光治疗剂。设计的化合物(TD和TSD)分别以三苯胺(TPA)片段和DTM为供体和受体，进一步加入噻吩段作为补充供体和π-bridge，以增强D-A相互作用，并延长π-conjugation以获得更长的激发波长和更好的ROS生成。选择TPA段是因为它具有电子给体和分子内转子的双重作用。TD和TSD的螺旋桨状扭曲结构也通过减少分子间的堆叠效应，有效地增强了粒子内聚集体中的荧光。将含有更多杂原子的DTM引入光疗剂的分子结构中，有望提高TD (573 nm)和TSD (625 nm)的三重态激子产生能力系数(0.10)分别为≈3.3 × 104和2.1 × 104 L·mol−1·cm−1，表明它们具有出色的光捕获能力。TD的最大发射峰位于632 nm，而TSD的发射光谱在750 ~ 1250 nm范围内非常宽，最大发射峰在≈1000 nm处，说明其NIR-II荧光性质。随后，进一步研究了不同水馏分(fw)的THF/水混合物中TD和TSD的AIE特征。从图可以看出，当fw增加到70%时，荧光强度逐渐降低，这可能是由于D-A结构的TD和TSD具有较强的分子内电荷转移(ICT)性质，以及水的高极性。![]()
TD和TSD纳米颗粒的ROS生成及光热转化性能
为了增强胶体的分散性和生物相容性，疏水性TD和TSD分子随后通过改进的纳米沉淀法配制成纳米颗粒(NPs)，命名为TD NPs和TSD NPs，如图所示，其中生物相容性和两亲性共聚物2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺en -[甲氧基(聚乙二醇)- 2000 (dpe - peg2000)被用作封装基质。动态光散射(DLS)测量显示，TD NPs和TSD NPs的平均水动力直径分别为98.2 nm和91.3 nm，通过增强渗透性和保留(EPR)效应，适合肿瘤蓄积。透射电镜(TEM)显示，TD NPs和TSD NPs均呈均匀的球形形貌。透射电镜观察到的TD NPs的尺寸为≈68.6 nm, TSD NPs的尺寸为72.1 nm，小于DLS发现的水动力尺寸，可能是由于在TEM样品制备过程中PEG层的脱水和收缩。在660 nm激光照射(0.4 W cm−2)下评估光疗性能。最初选择2 '，7 '二氯二氢荧光素(DCFH)作为总ROS生成的指标。如图所示，在TD NPs和TSD NPs存在的情况下，DCFH荧光信号在180秒内随660 nm激光照射迅速放大，表明它们具有良好的ROS生成能力。而在相同条件下，商用光敏剂氯E6 (Ce6)和吲哚菁绿(ICG)分别表现出中等和较差的DCFH荧光增强。值得注意的是，TSD NPs触发的DCFH荧光增强因子分别比TD NPs、Ce6和ICG高≈177.02、≈1.34-、2.72-和19.10倍，初步证明TSD NPs具有最强的ROS生成性能。鉴于TSD NPs比TD NPs产生ROS的能力更强，我们以TSD NPs为例进一步研究这些产生ROS的类型。使用9,10蒽二基双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)进入1O2的生成，结果表明，在660 nm激光照射(0.4 W cm−2,5 min)下，TSD NPs和Ce6的ABDA吸光度分别下降了≈20.4%和16.96%，显示新界沙田核电厂的臭氧发电能力相对较差。然后分别以二氢膦胺123 (DHR123)和羟基荧光素(HPF)作为超氧自由基(O2•−)和羟基自由基(•OH)指标评估I型自由基ROS的生成。如图所示，TSD NPs在90秒的超短照射时间内显著增强了DHR123的荧光信号。用DHR123荧光增强量化O2•−生成性能表明，TSD NPs的O2•−生成能力分别比Ce6和ICG高1.88倍和43.2倍。此外，在660 nm激光照射下，Ce6或ICG存在时，HPF荧光信号几乎没有变化，说明在660 nm激光照射下Ce6或ICG没有生成•OH。然而，TSD NPs在辐照后10 s内显著放大了HPF荧光信号，荧光增强因子为≈19.23，分别比Ce6和ICG高≈9.71-和12.09倍。我们还对缺氧条件下TSD NPs的ROS生成能力进行了评价，激光照射下DCFH的荧光强度逐渐增强，激光照射180 s后增强了72.15倍，表明TSD NPs即使在无氧条件下也能产生ROS。![]()
TSD NPs体外抗癌活性研究
为了进一步评估TSD NPs对OSCC的根除能力，我们以人舌鳞癌(Cal27细胞系)为模型细胞系进行了一系列体外实验。将Cal27细胞与100 μm TSD NPs孵育2小时，然后在0、0.2和0.4 W cm−2激光照射5分钟。首先，研究TSD NPs在癌细胞中的细胞内定位研究。实验结果表明，TSD NPs在孵育2小时内大量内化到Cal27细胞中，并被溶酶体包裹。随后，使用过氧化物敏感荧光探针DCFH-DA和共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)获取细胞内ROS水平。CLSM图像显示，由于PDT效应，在TSD NPs孵育和激光照射后，细胞内ROS积累显著增加，与仅PBS或激光照射的最小绿色荧光细胞形成鲜明对比。同时，TSD NPs +激光照射组观察到典型的凋亡形态学特征。通过CCK-8法检测TSD NPs对Cal27癌细胞的细胞毒作用。即使在高浓度的TSD NPs下也检测到最小的暗细胞毒性，表明具有良好的生物相容性。然而，激光照射后观察到细胞活力明显下降，TSD NPs浓度升高与细胞毒性增加相关。![]()
TSD NPs和辐照处理OSCC细胞的RNA-Seq分析
为了阐明TSD NPs对癌细胞细胞毒性作用的分子机制，我们采用rna测序(RNA-seq)方法分析了Cal27细胞的基因表达谱。分析确定了168个失调基因(94个上调，74个下调)。随后的基因本体(GO)富集分析显示，多种信号通路发生了显著变化，尤其是与热应激反应和细胞凋亡相关的信号通路。在各种数据库中发现的前30条富集途径包括抗原加工和递呈、hsf1介导的热休克反应调节、细胞对热应激的反应和凋亡信号通路。热休克反应和细胞对热应激反应的途径表明，TSD NPs诱导肿瘤细胞产生光热效应，从而导致应激反应。此外，测序数据表明，使用TSD NPs治疗有利于诱导肿瘤细胞死亡、凋亡和移除。京都基因与基因组百科全书(KEGG)疾病数据库分析进一步证实了这些发现，表明差异基因主要富集于线粒体相关疾病。基因集富集分析(GSEA)证实，通过主要组织相容性复合体(MHC) I类、T细胞分化的负调控和细胞对热应激的反应，与抗原加工和递呈相关的途径上调。肿瘤细胞上MHC-I抗原呈递增强，表明针对肿瘤细胞的免疫反应增强，可能改善T细胞的识别和消除，表明TSD NPs光疗后这些Cal27细胞对免疫治疗的敏感性增加。免疫印迹分析进一步验证了RNA-seq结果，通过分析关键凋亡蛋白的表达变化，揭示了处理后凋亡通路的显著富集。在TSD NPs和激光治疗后，Cal27细胞中观察到cleaved Caspase-3、BAX的显著上调，凋亡通路关键蛋白BCL2的表达水平下调。随后对热信号相关蛋白的响应分析显示，TSD NPs处理显著提高了热休克蛋白90 (HSP90AA1)和热休克转录因子1 (HSF-1)的水平，表明TSD NPs的光热效应触发细胞的应激反应。![]()
体内TSD NPs的光免疫治疗
发生在口腔粘膜部位的OSCC往往受到复杂的口腔微生物群、唾液、龈沟液、唾液淀粉酶等成分的影响，这是皮下环境无法模拟的。为了扩大我们的策略的翻译相关性，我们采用了一个原位肿瘤模型来评估TSD NPs和PD-L1联合治疗的OSCC根除效果。粘膜下接种mtcq -荧光素酶细胞，模拟OSCC的致瘤性。第14天，将50 μL的TSD NPs (100 μm)原位注射到舌缘黏膜下。在注射后的不同时间间隔进行NIR-II荧光成像。由于NIR-II窗口的自身荧光很小，在舌肿瘤组织中只观察到明亮的荧光信号，随后由于TSD NPs的代谢，荧光信号逐渐减弱。注射后8小时，小鼠舌中仍可检测到NIR-II荧光，为光疗程序提供了足够的时间窗口。半定量分析荧光强度也有类似的观察结果，12 h后舌部肿瘤区域荧光最小，提示TSD NPs机体清除快，生物安全性好。然后在NIR-II荧光的引导下，对舌组织进行5分钟的激光照射(0.2或0.4 W cm−2)。红外热图像显示肿瘤区域温度迅速升高，在0.2和0.4 W cm−2激光照射5分钟后，高原温度分别升高6°和16°C，为光疗和抗肿瘤免疫激活提供了足够的局部热量。在肿瘤接种后第10天，将携带mtcq -荧光素酶细胞的小鼠随机分为7组，分别为对照组、TSD NPs、αPD-L1、TSD NPs+0.2 W cm−2、TSD NPs+0.4 W cm−2、TSD NPs+0.2 W cm−2+αPD-L1和TSD NPs+0.4 W cm−2+αPD-L1。然后，从选定的组小鼠局部注射TSD NPs或PBS，然后静脉注射PD-L1或PBS，并进行或不进行激光治疗。长期监测肿瘤生长情况。veh注射组和TSD nps组肿瘤自然进展。αPD-L1单独使用可轻微抑制肿瘤生长。而TSD NPs联合激光照射和PD-L1可显著抑制肿瘤生长。荧光强度定量分析也显示了相同的结果。重要的是，与pbs治疗组相比，TSD nps介导的光疗和αPD-L1治疗显著延长了小鼠的生存时间。同样的发现也反映在提取肿瘤的照片中，其中小鼠舌头的大小和形状在治疗后恢复正常光疗法和αPD-L1。我们的体内研究表明，TSD NPs与PDT/PTT和αPD-L1具有显著的协同作用，在OSCC模型中显著减少肿瘤并提高生存率。![]()
我们在此展示了具有特殊近红外发射，平衡ROS和光热转化能力的“all In one”光疗剂(TSD)与αPD-L1 ICB免疫疗法联合治疗OSCC的潜在抗肿瘤功效。通过引入包含多个杂原子作为电子受体的新型吸电子单元DTM，实现了强大的TSD。DTM克服了传统的强电子受体由于氰基的强伸缩振动而产生ROS的限制。具体而言，TSD NPs在近红外激光照射下巧妙地实现了明亮的NIR- II荧光、高效的I型ROS生成和高光热转换效率(45.3%)。此外，TSD NPs还能高效诱导线粒体膜损伤和癌细胞凋亡，激活ICD过程，从而刺激强大的抗肿瘤免疫激活，促进t细胞在肿瘤微环境中的浸润。值得注意的是，TSD NPs与αPD-L1免疫疗法的协同联合可以在体内完全根除肿瘤，而不会对正常组织产生不良影响。本研究不仅为光疗提供了具有均衡治疗模式的定制光疗剂的设计，而且为OSCCs的临床治疗提供了新的和有希望的机会。参考文献
https://doi.org/10.1002/smll.202405470
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