内容提要
我们报道了一种自加速纳米平台，结合了聚集诱导发射发光原（AIEgen）和低氧反应前药，用于多功能图像引导联合免疫治疗。甲氧基取代的近红外AIEgen具有较强的光吸收能力，同时具有增强的荧光和光声（PA）亮度，并通过增强的系统间交叉过程增强了I型和II型光动力治疗（PDT）性能。通过将高性能AIEgen与低氧反应性紫杉醇（PTX）前药配制成纳米颗粒，并进一步与巨噬细胞细胞膜伪装，构建肿瘤靶向治疗剂。荧光和PA成像的结合有助于灵敏地描绘肿瘤部位，为肿瘤治疗提供准确的指导。光致PDT效应可消耗局部氧气，导致严重缺氧，加速PTX药物释放。PDT和PTX联合化疗可诱导免疫原性癌细胞死亡，在4T1荷瘤雌性小鼠中不仅可引发较强的抗肿瘤免疫抑制原发肿瘤，还可抑制远处肿瘤的生长。
AIEgens的合成与光物理性质
首先设计并合成了两种具有不同取代物的供体-受体-供体（D-A-D）型化合物，以获得低带隙发色团。本文以四苯基乙烯（TPE）或甲氧基取代TPE （MTPE）和噻吩[3,4-c][1,2,5]噻二唑（TT）分别作为D和A基团。TPE是一种广泛使用的构建AIEgens的构件，而MTPE是一种具有更强给电子性的衍生物。TT是常用的电子受体苯并噻唑的类似物，但预计TT对类醌共振结构和超价硫原子具有更强的吸电子能力。分子通过TPE或MTPE的单硼酸酯与2,5-二溴-3,4-二硝基噻吩的Suzuki交叉偶联反应合成，得到二硝基化合物，然后还原为二氨基中间体，然后与n -亚砜苯胺进行合环反应，得到目标分子。TPE-TT和MTPE-TT具有良好的可加工性，易于在甲苯、二氯甲烷、四氢呋喃等常见有机溶剂中溶解。由于强D-A相互作用减小了带隙，MTPE-TT的最大吸收波长（624 nm）与TPE-TT （609 nm）相比发生了红移。值得注意的是，MTPE-TT的最大摩尔吸收系数为2.49 × 104M-1 cm-1，远高于TPE-TT的1.85 × 104M-1 cm-1，有利于光的有效激发。为了研究不同聚集体状态下的荧光特性，记录了含不同馏分（fw）的THF/水混合物的光致发光（PL）光谱。在高极性环境下，当fw增加到60%或70%，形成扭曲ICT （TICT）态时，MTPE-TT和TPE-TT的PL强度都有所下降。TPE-TT在进一步增加fw时，PL强度略有增强，而MTPE-TT在更高fw时，由于聚集体的形成，PL增强非常明显。结果表明，MTPE-TT具有较强的AIE特征，而TPE-TT仅表现出较弱的AIE现象。我们进一步研究了这些分子在不同粘度环境下的荧光特性。随着N，N-二甲基甲酰胺(DMF)/甘油混合物中甘油分数（fg）的增加，荧光强度先降低后增强，这也可以归因于极性变化和AIE特征（Supplementary Fig. 25）。MTPE-TT在90% fg时的PL振幅增幅约为TPE-TT的8倍，与THF/water混合物的PL变化吻合较好，进一步证实了MTPE-TT更明显的AIE特性。MTPE-TT虽然具有较小的带隙，但由于突出的AIE特性，其PLQY也得到了增强。然后研究了活性氧的生成特性。用9,10-蒽二基-双（亚甲基）二丙二酸（ABDA）作为1O2的指示剂，用2′，7′二氯二氢荧光素（DCF-DA）检测ros9。在白光照射下，MNPs比TNPs表现出更强的1O2和ROS生成能力，这也表明在这种近红外发光材料中发生了I型和II型PDT过程。
M1巨噬细胞膜伪装NPs的表征
在确认MTPE-TT优异的光物理和PDT性能以及PTX-NB的缺氧响应特性后，利用Pluronic F127将MTPETT和PTX-NB共负载自组装成MPNPs。作为对照，我们也将PTX-NB与Pluronic F127组装制备了单独基于PTX-NB前药的NPs，命名为PNPs。为了使MPNPs具有肿瘤靶向能力，进一步在MPNPs表面包被M1巨噬细胞膜以获得仿生M1-MPNPs。M1巨噬细胞膜及其相关膜蛋白被认为可以作为抑制RES清除的隐藏斗篷，并作为肿瘤归巢导航器，增强炎症性肿瘤组织中NPs的积累61,62。膜包覆mpnp的制备如图所示。首先，用脂多糖（LPS） （100 ng mL-1）和II型干扰素（IFN-γ） （50 ng mL-1）刺激RAW264.7细胞24 h，诱导其进入M1表型。细胞形态由圆形变为梭形，表明巨噬细胞M1极化。流式细胞仪分析还显示，LPS和IFN-γ刺激RAW264.7细胞后，M1巨噬细胞特异性表面标志物CD86的表达水平非常高（99.2%），表明其成功转化为M1巨噬细胞63。然后用新提取的M1巨噬细胞膜反复挤压MPNPs制备膜装饰NPs。作为对照，采用膜挤压法制备M1巨噬细胞膜源性无NPs核的空纳米囊泡（M1NPs）。为了确认M1巨噬细胞膜中是否含有用于生成M1巨噬细胞的残余LPS和/或IFN-γ，进行了ELISA和流式细胞术分析。与对照M0巨噬细胞膜相比，M1巨噬细胞膜的LPS和IFN-γ水平没有增加。采用动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）研究了不同NPs的大小和形态。，PNPs、MNPs、M1NPs、MPNPs和M1-MPNPs的平均直径分别为83、106、121、111和126 nm。所有NPs在−10 eV以下均具有负zeta电位。TEM图像显示M1-MPNPs为均匀的球形结构，表面可见一层薄薄的细胞膜。此外，通过Western blotting分析证实了M1巨噬细胞膜和M1- mpnps上典型的M1巨噬细胞标志物CD86和iNOS的表达，这表明M1巨噬细胞膜成功包封在M1- mpnps表面。HPLC法计算出M1-MPNPs中PTX-NB的载药量约为8.3%。NPs还具有良好的胶体稳定性，在PBS和血清中保存4天后，几乎没有观察到直径变化。此外，考虑到肿瘤的弱酸性环境（pH在6.5 - 7.0左右），我们还研究了M1MPNPs在pH 6.5时的稳定性，它们在这种弱酸性环境下也表现出良好的稳定性，这与前人的研究结果一致。未来，我们将深入研究膜包被NPs在更复杂生理条件下的稳定性和完整性。，M1-MPNPs的激发-发射图表明，它可以在550 ~ 700 nm的宽光谱区域内被激发，并在750 ~ 1000 nm范围内表现出明亮的近红外荧光发射。
体外细胞研究
考虑到M1-MPNPs在缺氧条件下具有良好的光诱导ROS生成和化疗特性，我们在体外检测了其抗肿瘤能力。首先通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）评估不同细胞对MPNPs和M1-MPNPs的摄取情况。如图所示，用MPNPs或M1-MPNPs（5µg mL−1）在37℃下培养4 h的4T1癌细胞的CLSM图像显示，与未经M1巨噬细胞膜修饰的MPNPs相比，4T1癌细胞可以内化更多的M1-MPNPs。定量计算表明，M1- mpnps处理的细胞的红色荧光强度比mpnps处理的细胞高近2倍，表明M1膜伪装具有良好的肿瘤细胞靶向能力。然而，当这两种NPs与RAW264.7巨噬细胞在37℃下孵育4小时时，CLSM图像显示相反的结果，在m1 - mpnps处理的细胞中观察到较弱的荧光信号。健康上皮细胞对M1MPNPs的摄取也被评估。人乳腺上皮细胞（MCF-10A）和肾近端小管上皮细胞（HK-2）与M1-MPNPs孵育后，荧光信号明显弱于4T1癌细胞，表明M1-MPNPs对癌细胞的靶向能力优于健康上皮细胞。我们进一步测试了膜蛋白，以深入了解这种肿瘤靶向现象。根据以往的研究，来自巨噬细胞膜的遗传蛋白如CD47可以通过结合巨噬细胞65上表达的SIRPα来阻止巨噬细胞介导的不良吞噬。另一方面，巨噬细胞细胞膜上的α4和β1整合素可与癌细胞上的血管细胞粘附分子-1 （VCAM-1）积极结合，使其具有靶向肿瘤的能力。如western blotting分析所示，我们还观察到这些相关蛋白，包括CD47、α4和β1整合素在M1巨噬细胞膜和M1- mpnps上的表达。我们使用DCF-DA来评估不同NPs的细胞内ROS生成能力。MNPs和M1-MPNPs（5µg mL−1）在白光照射（10 mW cm−2,3 min）下均能产生高浓度的ROS，处理后的4T1细胞从DCF-DA产物中显示出明亮的绿色荧光信号，证实了MTPE-TT优异的PDT特性。然后，我们用高效液相色谱法研究了PTX-NB前药在肿瘤细胞中的活化作用。结果表明，PDT过程可以加速细胞内PTX- nb向游离PTX的转化。采用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）2,5-二苯基溴化四氮唑（MTT）测定不同条件下不同NPs的细胞毒性。4T1细胞用不同浓度的PBS、MPNPs或M1-MPNPs孵育，然后不处理或光照。单独光照射的细胞毒性可忽略不计，而其他各组的细胞活力均呈浓度依赖性下降。特别是，M1-MPNPs加光处理的细胞活力明显低于M1-MPNPs和“MPNPs + L”处理的细胞。annexin-V和Sytox Green共染色法结合流式细胞术分析细胞死亡情况。Annexin-V染色常用来检测凋亡细胞上的磷脂酰丝氨酸暴露，Sytox染料可以通过与细胞核酸结合，渗透到死亡细胞中，对死亡细胞进行强荧光染色。“M1-MPNPs + L”处理后，Annexin V+和Sytox Green+细胞的范围大大增加，表明细胞凋亡和死亡水平较高。结果与MTT实验一致，揭示了M1-MPNPs在光照下具有强大的肿瘤细胞杀伤能力。此外，我们研究了使用不同种类的细胞死亡抑制剂调节细胞死亡的类型。例如，Liproxstatin-1 （Lip-1）、zVAD-fmk和Necrostatin 1s （Nec1s）分别被用作铁下垂、细胞凋亡和坏死性下垂的抑制剂。“M1-MPNPs + L”引起的细胞死亡仅被Lip-1处理轻微抑制。然而，z-VAD-fmk或Nec1s显著抑制细胞死亡，提示凋亡和坏死下垂是本研究中涉及的两种主要细胞死亡形式。此外，为了证明PTX-NB前药基纳米平台对正常细胞的副作用降低，M1-MPNPs与MCF-10A上皮细胞孵育。作为对照，用游离PTX替代PTX- nb前药制备游离PTX基NPs （M1-MFNPs）。MTT实验表明，M1-MPNPs对MCF-10A细胞的细胞毒性明显低于M1MFNPs。综上所述，这些结果表明，结合PDT，化疗和肿瘤细胞靶向的M1-MPNPs是一种在光触发下显著杀死癌细胞的有效药物。
荷瘤小鼠体内荧光和PA成像
在4T1荷瘤小鼠尾静脉静脉注射MPNPs或M1-MPNPs后，在体内显像系统（IVIS）下对小鼠进行成像。MTPE-TT在肿瘤部位观察到明显的近红外荧光信号，在注射后约24 h荧光强度达到最大，提示肿瘤成像和治疗的最佳时间点。有趣的是，M1-MPNPs处理小鼠的荧光信号比MPNPs高约1.6倍，表明M1巨噬细胞膜包被介导的肿瘤蓄积能力更好。此外，即使在给药后48 h，肿瘤部位仍能观察到较强的近红外荧光信号，表明NPs具有长期的体内肿瘤成像能力。荧光成像具有较高的灵敏度，但穿透深度和空间分辨率有限。相比之下，PA成像可以提供超过光学扩散极限的大穿透深度，同时保持高空间分辨率。由于M1-MPNPs在近红外光谱区表现出较强的吸收和PA信号，我们接下来进行了体内PA成像，以获得更详细的肿瘤信息。肿瘤的PA振幅表现出与荧光成像相似的时间依赖性，同样在静脉给药后24 h达到最高。在680 nm激发下的PA图像有助于以高对比度描绘肿瘤区域的位置和形状。因此，体内荧光和PA成像提供了肿瘤部位的全面信息，有助于指导治疗过程。研究了M1MPNPs的生物分布。将NPs静脉注射于荷瘤小鼠24 h后，切除主要脏器和肿瘤，在IVIS下成像。M1-MPNPs处理的小鼠肿瘤表现出比MPNPs高得多的近红外荧光信号，而肝脏和脾脏的NPs积累减少，这可能是由于M1巨噬细胞细胞膜可以帮助NPs逃离res，这与之前的细胞实验结果一致，M1-MPNPs在RAW264.7细胞中摄取较少。为了检测NPs在肿瘤组织中的位置，我们将不同NPs处理的小鼠的肿瘤切片，在荧光显微镜下观察。肿瘤切片也用抗cd31抗体染色以显示血管。有趣的是，M1-MPNPs处理的肿瘤的近红外荧光信号比MPNPs组强，特别是在肿瘤深部（≈2.5 mm）。注射M1-MPNPs的小鼠肿瘤深部的近红外荧光信号比MPNPs处理的小鼠高约7倍。M1- mpnps具有优异的肿瘤穿透能力，可能与M1巨噬细胞膜伪装介导的肿瘤细胞靶向性增强有关。
光触发自加速M1-MPNPs用于肿瘤协同免疫治疗
通过肿瘤预防接种实验，检测“M1-MPNPs + L”诱导的肿瘤细胞ICD在体内是否具有免疫原性。将经“M1-MPNPs + L”预处理的4T1肿瘤细胞于第0天皮下注射到小鼠左侧，建立抗肿瘤免疫。以注射PBS的小鼠为对照。第7天，在小鼠右侧皮下注射活的4T1肿瘤细胞攻毒。每2天监测右侧肿瘤生长情况。用“M1-MPNPs + L”杀死的4T1细胞预防性接种，可保护小鼠免受后续肿瘤细胞的再攻，与PBS组相比，肿瘤生长受到极大抑制。在证实M1-MPNPs具有良好的ICD诱导和肿瘤成像能力后，我们进一步研究了其在4T1荷瘤BALB/c小鼠中的免疫治疗特性。七天后肿瘤noculation(肿瘤体积≈80 mm3),带有小鼠随机分为7组(n = 5老鼠/组),包括PBS、pnp型,基于+ L, M1NPs, MPNPs + L, M1-MPNPs,和M1-MPNPs + L .静脉注射后24小时不同的NPs(200μL、500μg毫升−1),肿瘤组与“L”的网站在白光照射(0.3 Wcm−2)10分钟,这是进行两次每天0和3。每隔一天监测接受不同治疗的小鼠的肿瘤体积。“M1-MPNPs + L”组的肿瘤生长受到极大抑制，第14天的平均肿瘤体积仅为7.6 mm3，远小于“MPNPs + L”组（242.7 mm3）和PBS组（1545.6 mm3）。“M1-MPNPs + L”处理小鼠的最终平均肿瘤重量仅为53 mg，分别比PBS （1168 mg）、PNPs （798 mg）、MNPs + L （266 mg）、M1NPs （1053 mg）、MPNPs + L （477 mg）和M1-MPNPs （629 mg）组小22、15、5、20、9和12倍。此外，不同处理的小鼠体重差异可以忽略不计，说明所有处理的生物安全性都很好。M1- mpnps加光的优越抗肿瘤效果主要源于其强大的PDT作用和自加速激活缺氧反应的PTX前药，以及M1巨噬细胞膜增强的肿瘤归巢。
总结
我们开发了一种结合近红外AIEgen和缺氧反应前药的有机光疗平台，可以实现肿瘤的荧光和PA双模成像，以及由强PDT效应和自加速化疗介导的联合免疫治疗。验证了甲氧基取代TPE是提高AIE特性和摩尔吸收系数，同时提高荧光和PA亮度的有效策略。值得注意的是，在MTPE-TT中，I型和II型PDT过程都通过更有效的ISC转变而被放大。将高性能的AIEgen和ptx为基础的低氧反应前药配制成有机NPs，可以进一步与M1巨噬细胞细胞膜伪装，提高肿瘤靶向能力。荧光和PA成像的互补优点允许对肿瘤部位进行敏感的描绘，为光疗提供准确的指导。光产生的ROS能够诱导肿瘤细胞的ICD，在此过程中，氧气消耗导致严重缺氧，触发PTX的释放，增强抗肿瘤免疫反应。得益于优异的PDT特性和自加速化疗前药，该纳米平台能够激发强大的抗肿瘤免疫，同时抑制原发肿瘤和远处肿瘤。本工作提出甲氧基取代是一种通过增强AIE效应来提高荧光亮度，通过增强光吸收能力来提高PA强度，通过增强ISC过程来促进I型和II型PDT的有效方法。结合PDT药物和低氧反应前药的自加速策略是开发强大的免疫治疗药物以促进基于icd的抗肿瘤治疗的有效途径。
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