内容提要
光动力疗法(PDT)作为一种有效的、无创的癌症治疗方式，已引起人们的广泛关注。随着近年来光敏剂、光纤系统等方面的研究进展，光敏剂的应用范围已广泛扩展到浅表和局部癌症。然而，临床上使用的少数光敏剂，大多存在治疗后光敏时间延长的缺点。因此，PDT后管理也是一个至关重要的问题。本文报道了一种简单的生物正交方法，可以有效地抑制裸小鼠PDT的这种常见副作用。它涉及使用一种解毒剂，该解毒剂含有一种黑洞猝灭剂BHQ-3，它与双环[6.1.0]非4-炔(BCN)部分共轭，以及一种四嗪取代的硼二吡咯烷基光敏剂。以荷瘤裸鼠为动物模型，证明了该光敏剂PDT后，解毒剂可以通过快速咔嗒反应使BHQ-3猝灭剂靠近光敏单元，有效地猝灭残留光敏剂的光动力学活性。
分子设计与合成
本研究选择具有扩展共轭的BODIPY染料作为本研究的光敏剂，使其在远红色区域具有响应性。该化合物标记为PS-Tz。在IEDDA反应中引入四氮单元以促进与bcn取代猝灭剂的偶联。虽然四嗪部分可以有效地猝灭非𝜋-extended BODIPYs的光活性，但对于二酰基BODIPYs来说，它不是一个很好的猝灭剂。据报道，四嗪不能有效地淬灭在远红色和近红外区域发射的染料的荧光。对于解毒剂BCN- q，它包含一个用于生物正交耦合的BCN片段和一个黑洞猝灭剂BHQ-3片段。这种非发光偶氮染料具有多芳族偶氮骨架，由于适当的光谱重叠，通过Förster共振能量转移(FRET)机制，是众所周知的红色和远红色荧光团的暗猝灭剂，涉及偶氮桥的光化学异构化，提供了有效的非发射弛豫途径。除了荧光发射外，该染料还可以通过FRET有效地淬灭一系列光敏剂的ROS生成能力。通过监测PBS中PS-Tz (1 μm)在0.1% tcn - 80 (v/v)存在和不存在不同浓度的BCN-Q(1、2和3 μm)的情况下24 min的荧光光谱变化，研究了BCN-Q对PS-Tz的生物正交猝灭作用。加入表面活性剂tcn - 80提高了PS-Tz在水溶液中的溶解度，减少了化合物的聚集。我们发现，在没有BCN-Q的情况下，这段时间内的频谱几乎没有变化。添加BCN-Q(1、2和3 μm)后，约700 nm处的荧光带大量减弱，几乎是自发的。如图所示，702 nm处荧光强度随时间变化，当加入1 μm的BCN-Q时，荧光强度在约12 min后降至最小，而当加入2或3 μm的BCN-Q时，荧光强度缩短至约6 min。有效的猝灭可以归因于通过IEDDA反应与BHQ-3部分的共价键。为了提供进一步的证据，还使用了市售的非BHQ-3取代的BHQ-3胺NH2-Q和非BHQ-3共轭的BCN衍生物3进行了比较。我们发现，当NH2-Q浓度为3 μm时，PS-Tz (1 μm)的荧光强度在整个时间内只是略有降低，表明click过程对于PS-Tz的荧光有效猝灭是必不可少的。正如预期的那样，在没有猝灭成分的情况下，BCN 3不能显著改变PS-Tz的荧光强度。
体外生物正交失活
在细胞水平上进一步证实了BCN-Q对PS-Tz的生物正交失活作用。将HT29人结肠腺癌细胞先用PS-Tz (1 μm)孵育6 h，然后分别在含NH2-Q或BCNQ (2 μm)或不含NH2-Q的培养基中孵育1 h，再用PS-Q (1 μm)孵育6 h，不进行后处理或仅用BCN-Q (2 μm)孵育1 h。其共聚焦图像和定量的细胞内荧光强度分别如图所示。PS-Tz处理后的细胞有明亮的荧光，NH2-Q后处理后的细胞荧光强度仍然很强。相比之下，用BCN-Q后处理的细胞，荧光强度降低了约5倍，与用PS-Q孵育的细胞相当，表明细胞内的PS-Tz基本上被BCN-Q完全失活。正如预期的那样，暗猝灭剂BCN-Q的细胞内荧光可以忽略不计。使用另外两种细胞系进行了类似的研究，即A549人肺癌细胞和HepG2人肝癌细胞。如图所示，细胞后处理BCN-Q后，PS-Tz的细胞内荧光强度也大幅降低，其程度与HT29相似(约为5倍)。结果表明，BCNQ通过生物正交偶联可以有效地抑制肿瘤细胞内PS-Tz的荧光发射。
体内生物正交失活
我们进一步用小鼠模型研究了生物正交失活效果。首先在PBS中以0.1% Tween 80 (v/v) (20 nmol, 100 μL)的浓度静脉注射PS-Tz雌性BALB/c小鼠。24 h后，以PBS (40 nmol, 200 μL)或PBS (200 μL)为对照静脉滴注BCNQ。图中为小鼠在注射PS-Tz后24 h和再静脉注射bn - q或PBS 24 h后，用红外成像系统(激发波长= 680 nm，发射波长≥700 nm)记录的近红外荧光图像。注射PS-Tz后24 h，小鼠全身可见明显的强荧光。进一步注射BCN-Q后，与PBS注射后的对照组相比，全身荧光强度随时间明显降低。即使在10分钟后，效果也很显著，这可能是PS-Tz与BCN-Q之间快速IEDDA反应的结果。这个特性对于解毒剂来说是非常理想的。
体内PDT后生物正交失活
在使用PS-Tz进行体内PDT研究之前，先用上述红外成像系统监测其在HT29荷瘤裸鼠体内静脉注射(20 nmol, 100 μL) 48 h后的生物分布。如图所示，随着时间的延长，小鼠体内的荧光强度逐渐增强。在肿瘤部位，荧光强度也随时间增加，在24 h后几乎达到最大。注射后48 h的离体研究显示，肿瘤单位面积的荧光强度与一些主要器官相当，甚至更高。这些结果表明，PS-Tz可以随时间在肿瘤中积累，这使得它可以用于光动力消除肿瘤。然后按照图所示的程序研究PS-Tz对HT29荷瘤裸鼠的PDT效果和光动力处理后BCN-Q的生物正交失活效果。简单地说，就是在小鼠背部皮下接种HT29细胞。当肿瘤体积达到≈60 mm3时，静脉注射PS-Tz (20 nmol)。24 h后，当该化合物在肿瘤中的积累几乎达到最大值时，用675 nm的二极管激光器照射肿瘤，以0.3 W的功率照射10分钟(总能量为180 J cm−2)(标记为laser -1)，开始光动力治疗。小鼠静脉注射BCN-Q (40 nmol)。24 h后，几乎所有PS-Tz都被BCN-Q猝灭，再用另一束激光(675 nm, 0.6 W, 360 J cm−2，标记为laser -2)照射小鼠背部，研究BCN-Q的生物正交失活效果。我们首先关注了PS-Tz的体内PDT功效。图中为上述治疗组和不同对照的肿瘤生长曲线。可以看出，对于静脉注射PBS而不对肿瘤施加Laser-1的阴性对照，肿瘤持续生长超过14天。在不进行激光治疗的情况下，只给小鼠注射PS-Tz也出现了类似的情况。相比之下，无论是否使用BCN-Q和Laser-2，在对小鼠进行PS-Tz处理后再进行Laser-1处理，肿瘤的生长都受到了极大的抑制，说明PS-Tz具有较强的抗肿瘤PDT作用，而BCN-Q和Laser-2的后处理不影响其PDT效果。对于接受激光-1治疗的组，肿瘤处可以清楚地看到疤痕，并逐渐消失。这应该是PS-Tz的光动力效应造成的，而不是我们之前[30d]及以下所确认的激光照射。
总结
我们已经开发了一种新的和前所未有的生物正交策略来解决PDT后引起的光敏性问题。它涉及到使用解毒剂BCNQ，它含有一个BCN片段，可以与光敏剂PS-Tz的四嗪取代基快速点击，以及一个BHQ-3猝灭剂，可以通过FRET过程有效地猝灭PS-Tz共价键后的荧光发射和ROS的产生。这些光活性的有效猝灭已经在PBS和一系列使用各种控制的癌细胞系中得到证明。以裸鼠作为动物模型，研究也表明，注射该解药可以有效地使小鼠体内残留的光敏剂失活，而不影响PDT的功效。特别是PS-Tz PDT后，BCN-Q后处理后的皮肤组织损伤最小，可以从皮肤的物理外观以及H&E和TUNEL染色中看出。与使用可活化光敏剂增强肿瘤特异性和减少非靶部位的不必要光损伤的方法相比，这种高效的生物正交失活策略不受肿瘤细胞和正常细胞中相应刺激水平的细微差异的影响。其直接的“点击-熄灭”机制确保在光动力处理后，体内残留的光敏剂可以有效地失活。综上所述，这种生物正交法可以有效地抑制裸小鼠PDT后的光敏性，可能有助于减少PDT常见的副作用，从而促进其临床应用。
参考文献
https://doi.org/10.1002/advs.202306207
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