内容提要
利用线粒体黏度作为纽带研究心肌缺血再灌注损伤（MIRI）中的铁下垂，为MIRI治疗提供了巨大的希望。然而，由于线粒体膜电位受损引起的静电相互作用的削弱，线粒体粘度的高精度可视化仍然是一项艰巨的任务。在此，我们提出了一种结合静电力和探针-蛋白质分子对接的双锁定线粒体靶向策略。即使在受损的线粒体中，由于开发的探针，CBS和线粒体膜蛋白之间的持续驱动力（例如pi-阳离子，pi-烷基相互作用等），在触发和药物MIRI中实现了线粒体粘度的稳定和精确可视化。此外，辅以western blot，我们证实了铁抑素-1通过改善系统xc /GSH/GPX4抗氧化系统来发挥其对MIRI的治疗作用，证实了铁中毒对MIRI的治疗价值。这项研究提出了一种开发强大线粒体探针的新策略，从而推进了MIRI的治疗。
评估CBS的光学特性
CBS在低粘度甲醇中在约450 nm处出现吸收峰，在高粘度甘油中吸收强度略有增加。同样，随着甘油比例从0增加到99%，探针CBS在615 nm处的发射强度显著增加，显示出粘度敏感性。此外，探针CBS的最佳发射强度与介质粘度呈良好的线性相关关系，相关系数高达0.998，进一步证实了CBS的粘度响应特性。此外，在不同的酸性和碱性环境下记录探针的发射光谱，结果表明，CBS的发射光谱几乎不受环境pH的影响。考虑到探针追踪生物过程的可行性，研究了探针CBS在甲醇和甘油中最佳发射波长下的信号光稳定性。输出信号表明，随着时间的增加，探针CBS的荧光强度在低粘度和高粘度体系中都保持稳定。
CBS的双锁线粒体靶向能力
为了探索探针稳定标记线粒体的能力，CBS与市售的线粒体示踪剂绿色（MTG）在H9C2细胞中共孵育。如图所示，所有细胞都以黄色照亮，表明TRICT通道（CBS）和FITC通道（MTG）之间高度重叠。此外，红色和绿色通道中三个感兴趣区域（roi）穿过细胞的强度分布表明，探针CBS的空间分布与细胞内MTG的空间分布一致。此外，从六个独立的生物重复中量化出近似0.956的Pearson相关系数，进一步证实了探针对线粒体的高驱动和靶向能力。为了进一步验证双靶向策略对增强线粒体标记的积极作用，我们以广泛用于检测线粒体膜电位的理想荧光探针JC-1 （ΔΨm）作为对照。在正常情况下，JC-1在线粒体基质中形成聚集体，产生强大的红色荧光信号。相反，在不健康的线粒体中，膜电位减少或丢失，JC-1仅以单体形式存在于细胞质中，导致绿色荧光信号。在本研究中，我们用CCCP（一种降低线粒体膜电位的化学物质）处理H9C2细胞，导致JC-1从线粒体渗漏。此外，Pearson系数的降低进一步证实了膜电位损伤前后JC-1的定位差异。然而，在cccp处理的细胞中，探针CBS在荧光强度或信号定位方面没有表现出任何显著的变化。为了确认结果，CellLight™线粒体-GFP利用绿色荧光蛋白（GFP）标记活细胞中的线粒体，并且不受线粒体活性的影响，在cccp处理的细胞中分别与商用线粒体跟踪器红色（MTR）和CBS共孵育。线粒体- gfp和MTR的合并图像显示，一部分MTR存在于线粒体外，这表明一些MTR已经从线粒体中泄漏出来。相比之下，线粒体- gfp和CBS染色细胞的合并图像和3D表面图显示明显的黄色，Pearson相关系数为0.95，表明所提出的探针CBS可以承受膜电位的损失和探针逃逸。我们假设在探针CBS和线粒体之间存在其他非静电力，并将这种神秘的力归因于CBS和线粒体膜蛋白（MMPs）之间的相互作用。
MIRI期间心肌细胞线粒体黏度的实时成像
我们采用先前报道的缺氧-葡萄糖-血清剥夺3.0 h，再灌注2.0 h的方法，在H9C2细胞中建立了MIRI模型。与对照组相比，我们观察到处理后的细胞在缺氧后再充氧后，红色荧光强度显著增加。由于探针CBS对粘度敏感，对其他生物学相关物种没有显著反应，这表明线粒体粘度在MIRI过程中增加。此外，荧光成像统计数据进一步支持H/R后细胞内荧光强度增加的事实。除了这些观察外，我们还注意到缺氧和再氧化后细胞形态的变化，如细胞收缩和完整形态的丧失。我们将这些现象归因于细胞内ROS的过量产生，ROS氧化脂质和蛋白质结构，最终导致细胞形态的改变。我们使用了mitoSOX红色荧光试剂，该试剂以其特异性靶向活细胞中的线粒体而闻名。该试剂有效地经受线粒体内产生的超氧化物的氧化，在与核酸结合时产生明显的红色荧光。因此，荧光强度间接代表线粒体ROS水平。MIRI组细胞的红色荧光强度明显高于对照组，表明ROS产生过多。因此，H/R处理导致线粒体ROS水平显著增加。
铁死亡对缺血再灌注损伤的可视化影响
MIRI是再灌注治疗的重要并发症，其发病机制是多方面的。铁下垂与MIRI密切相关，研究铁下垂有助于了解MIRI的发病机制，并为开发相关治疗方法提供理论依据。铁抑素-1 （ferl -1）是最有效的铁死亡抑制剂，已被用于治疗MIRI，与MIRI组相比，fe -1处理后细胞的红色荧光强度明显降低，表明H/R过程引起的线粒体粘度增加有所缓解。同时，经fe -1处理后，细胞形态逐渐恢复完整。荧光统计和未配对t检验的结果也证实了fe -1处理后荧光下降，表明抑制铁下垂通路可以减轻缺氧/再氧合引起的细胞损伤。同时，使用MTT法评估细胞活力。与对照组相比，H/R后细胞活力显著下降约50%。然而，经Fer-1处理后，细胞活力明显恢复。为了进一步研究fer1对MIRI的治疗作用，我们使用MitoSOX监测fer1治疗前后细胞内ROS水平的变化，与MIRI模型组相比，fe -1治疗后细胞内ROS水平明显降低。这些发现证实，抑制铁下垂可减轻H/R引起的细胞损伤，提示铁下垂有可能成为MIRI的一种新的治疗方法。我们假设fe -1处理MIRI可能会降低ROS水平，从而减少对细胞的氧化损伤。显然，铁下垂减轻MIRI的机制尚不清楚。因此，进一步探索铁下垂治疗MIRI的分子机制有望为MIRI的预防提供新的见解。
总结
我们提出了一种结合传统静电吸附靶向和探针-蛋白对接原理的线粒体双锁靶向策略。值得注意的是，CBS和线粒体膜蛋白（如OPA1和TOM40）之间存在多种弱相互作用，如pi-阳离子和pi-烷基，使我们能够动态监测和可视化H/R过程中线粒体粘度的变化。使用CBS，我们证明了用铁下垂抑制剂Fer-1处理的MIRI细胞表现出线粒体粘度和细胞活力降低。此外，我们确定了铁致氧化系统关键组分水平的变化，并提出了铁致氧化1减轻MIRI的潜在分子机制。本研究为线粒体的高度稳定和准确标记提供了一种新的设计策略，即使在潜在的线粒体膜损伤的情况下，这将推动线粒体损伤相关疾病的探索。
参考文件
https://doi.org/10.1002/anie.202402537
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