ACS Nano: 新型供体-受体-供体近红外AIE荧光材料用于饥饿光热抗肿瘤和抑制肺转移

内容提要

本文利用二氟化硼（BFF）受体构建了NIR-II AIEgen，与PTQ-和bbt衍生的荧光团相比，该AIEgen在NIR-II发射和化学稳定性方面具有更好的综合性能。TPEBFF具有精细调节的分子内运动和强D - A相互作用强度，同时具有高摩尔消光系数（ε= 4.31 × 10⁴ M⁻¹ cm⁻¹）、强NIR-II发射（Φ = 0.49%）和光热效应（η = 58.5%），以及高稳定性。由于这些优点，整合TPEBFF和抗糖酵解剂2-脱氧-d -葡萄糖（2DG）构建的热敏纳米颗粒通过调节糖酵解和减少atp依赖性热休克蛋白，成功地用于成像引导光热抗肿瘤肺转移。    

二氟化硼甲酸乙酯染料的分子设计与表征

在我们的研究中，受体工程是为了构建一个具有理想的光物理性质和稳定性的AIEgen PTT系统。以甲氧基三苯胺为共同电子给体，我们成功合成了三个D-A-D荧光团，分别是Ph- PTQ、Ph-BBT和Ph-BFF，它们分别以PTQ、BBT和BFF为电子受体。所有中间体的综合合成途径和详细表征在支持信息中提供。得到三个分子后，对其吸收光谱和发射光谱进行了检测。如图所示，在THF溶液中，Ph-PTQ、Ph-BBT和Ph-BFF的主要吸收峰分别位于和796 nm。此外，这三种分子在815、1051和1087 nm处表现出最大的荧光发射。这些化合物的摩尔消光系数（MEC, ε）分别为1.28 × 104 M⁻¹ cm⁻¹、2.15 × 104 M⁻¹ cm⁻¹和4.75 × 104 M⁻¹ cm⁻¹。    

我们初步评估并比较了Ph-BFF和TPE-BFF的光物理性质。如图所示，Ph-BFF和TPE-BFF在600 ~ 1000 nm处对THF有较高的吸收，摩尔消光系数（MEC, ε）分别为4.75 × 10⁴ M⁻¹ cm⁻¹和4.31 × 104 M⁻¹ cm⁻¹。在THF溶液中，在900 ~ 1400 nm波长范围内也观察到明显的NIR-II荧光发射。然后，用THF/H₂O混合物研究Ph-BFF和TPE-BFF的荧光强度变化。随着混合物中H₂O含量（fw）的增加（从0%到50%），TPE-BFF的荧光强度略有降低，这归因于TICT现象。然而，当fw从50%增加到80%时，由于AIE效应较强，荧光强度明显增加。当比例进一步增加到90%时，强度略有下降，这可能是由于粒径对骨料形成的影响。Ph-BFF表现出与TPE-BFF相似的转化趋势。值得注意的是，与Ph-BFF相比，TPE- bff表现出更好的AIE效果，这可能是由于TPE单元增强了RIM效应。疏水AIEgens最初使用生物相容性两亲性聚合物DSPE-mPEG2000封装成纳米颗粒（NPs）。如图所示，TPEBFFNPs在水中的最大吸收波长为810 nm，最大发射波长为1084 nm。合适的吸收和发射波长使NPs成为使用易于获取的808 nm激光和高分辨率NIR-II体内生物成像进行PTT的理想选择。NIR-II区域的荧光亮度由量子产额和消光系数（Φ × ε）的乘积估计，是NIR-II在体内生物学应用的关键参数。以IR-26为参考，计算了Ph-BFF NPs和TPE-BFF NPs的相对量子产率。如图所示，计算得到TPE-BFF NPs在水中的相对量子产率为0.49%，高于Ph-BFF NPs的0.15%。使用NIR-II体内成像系统记录的体外图像也表明，TPE-BFF NPs表现出更强的NIR-II荧光强度。我们在808 nm安全强度为0.3W cm⁻²的激光下评估了Ph-BFF NPs和TPE-BFF NPs的体外光热转换性能。辐照5min后，Ph-BFF NPs （100 μg mL⁻¹）和TPE-BFF NPs （100 μg mL⁻¹）的温度可达63℃和57℃，Ph-BFF NPs和TPE-BFF NPs的光热转换效率分别为60.7%和58.5%。虽然TPE-BFF NPs的PTT值略低于Ph-BFF，但在57℃的温度下（100 μg mL⁻¹,0.3 w cm⁻²），TPE-BFF NPs足以对癌细胞产生有效的PTT。此外，与Ph-BFF NPs相比，TPEBFF NPs具有更高的量子产率，这应该有利于体内成像。此外，两种NPs的温度升高都表现出与激光功率密度和NPs浓度相关的行为。    

抗糖酵解和热敏纳米颗粒的制备

我们使用dpe - peg - mal和1,2-双棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DPPC）将NIR-II TPEBFF和2DG包裹成热敏纳米颗粒（TNPs），命名为TPE-BFF-D TNPs，用于后续的生物学实验。选择DPPC作为构建生物相容性TNPs的基础脂质，用于热敏释放2DG，因为它的相变温度约为41℃，略高于体温。采用透射电镜（TEM）和动态光散射（DLS）研究了808 nm激光照射前后TPE-BFF-D TNPs的形貌变化。如图所示，通过TEM和DLS观察，TPEBFF-D TNPs具有均匀的球形形貌，平均尺寸为~ 145 nm。在808 nm激光照射5分钟后，DLS测量的TPE-BFF-D TNPs的平均尺寸变化为~ 212 nm。在808 nm激光（0.3 W cm⁻²）存在下，细胞内TNPs分解成碎片，由于温度升高逐渐释放2DG。因此，随后发生2dg介导的抗糖酵解过程，导致下游乳酸和ATP水平降低。为了进一步研究这种功能设计，我们分别检测了癌细胞的细胞外乳酸和细胞内ATP水平。如图所示，当不使用808 nm激光时，所有三组分别使用PBS （I组）、TPE-BFF TNPs （II组）和TPE-BFF- d TNPs （III组）处理的4T1细胞内的细胞外乳酸水平变化可以忽略不计。在与TPE-BFF TNPs或TPE-BFF- d TNPs孵育后，用功率密度为0.3 W cm^{- 2}的808 nm激光照射，乳酸含量分别显著降低了约36.6%和70.0%。此外，与对照组相比，不同实验组的细胞内ATP表达趋势相似；乳酸也减少了大约41.2%和69.3%。随后，采用Western blot方法检测不同处理后的细胞内atp依赖性热休克蛋白（HSPs）。在TPE-BFF TNPs和808 nm激光同时治疗后，与单独激光治疗组相比，HSP70和HSP90的表达水平显著增加了约16%。热休克蛋白的上调主要源于细胞对热损伤的保护的内在反应。然而，用TPE-BFF-D TNPs和激光处理4T1细胞，由于2DG抑制糖酵解和ATP产生，导致热休克蛋白显著降低。这些发现表明，TPEBFF-D TNPs通过抑制2DG介导的糖酵解有效地阻碍ATP的产生，最终减少PTT过程中肿瘤细胞中HSPs的产生。    

体外实验

受TPE-BFF优异的光稳定性和理想的光热转换效果的鼓舞，我们随后在体外评估了其对4T1细胞的PTT效果。最初，在不同条件下处理4T1细胞后，使用CCK-8法评估TPE-BFF TNPs的细胞毒性。如图所示，单独使用TPE-BFF TNPs、激光照射或单独使用TPE-BFF- d TNPs均可获得较高的细胞活力。单独的PTT组表现出中等的细胞毒性（56.7%的细胞活力），而含有2DG的纳米颗粒在暴露于808 nm激光后表现出增强的细胞毒性（6.2%的细胞活力）。相比之下，TPE-BFF-D TNPs表现出可忽略不计的暗毒性，但对癌细胞表现出浓度依赖性的光毒性。这些发现表明，将2DG介导的抗糖酵解整合到PTT中是一种有希望提高治疗效果的策略。此外，通过钙黄素AM和碘化丙啶（PI）染色实验进一步证实了TPE-BFF-D TNPs的光疗效果，其中绿色和红色荧光信号分别对应于活细胞和死细胞。如图所示，在仅激光处理的对照组以及单独使用TPE-BFF TNPs或TPEBFF-D TNPs的对照组中，可以观察到明显的绿色荧光信号，表明在这些实验条件下细胞毒性最小。然而，同时使用TPE-BFF TNPs和激光处理的组，由于光热效应，同时出现了绿色和红色荧光。与此组相比，红色荧光信号的优势表明，在功率密度为0.3 W cm⁻²的808 nm激光照射下，TPEBFF-D TNPs的细胞毒性增强。    

体内NIR-II荧光成像引导抗肿瘤治疗

考虑到近红外区的吸收波段（700 ~ 900 nm）， NIR- ii窗口的发射波长（1000 ~ 1500 nm），以及NIR- ii范围内适度的相对荧光量子产率（0.49%），TPE-BFF分子显示出作为体内NIR- ii生物成像的候选分子的潜力。向4T1荷瘤小鼠静脉注射TPE-BFF-D TNPs后，AIEgen在肿瘤部位明显积累，在给药后12 h观察到明显的NIR-II荧光信号，并在48 h达到最大强度，表明TPE-BFF-D TNPs具有良好的肿瘤靶向能力，如图所示。此外，对主要器官和肿瘤进行离体成像。此外，成功地实现了小鼠血管的可视化，以研究TPE-BFF的成像能力。裸鼠静脉注射TPE-BFF- d TNPs (10 mg kg - 1 TPE-BFF)，然后使用配备长通滤光片的体内NIR-II成像系统在1300 nm、1350 nm和1400 nm波段进行成像。随着长通滤光片范围扩展到1400 nm，成像清晰度逐渐提高，半最大值时最小全宽度（fwhm）值为0.64 mm，最高信本比（SBR）值为2.90。这些结果突出了TPE-BFF作为NIR-II成像的强大工具的巨大潜力。    

将4T1肿瘤小鼠随机分为6组进行不同的治疗：(I)对照，（II）激光，（III） TPE-BFF TNPs, (IV) TPE-BFF TNPs +激光，(V) TPE-BFFD TNPs, (VI) TPE-BFF- d TNPs +激光。采用TPE-BFFD TNPs联合激光照射的2dgantiglycolysis介导的光热疗法成功地实现了肿瘤的完全根除，无复发。虽然使用TPE-BFF TNPs +激光的光热疗法在最初几天明显阻碍了肿瘤的生长，但在治疗后5天观察到肿瘤的再生加速。相比之下，对照组注射PBS或单独使用近红外激光照射，以及使用TPE-BFF TNPs或不使用激光照射的TPE-BFF- d TNPs治疗，对肿瘤生长的抑制作用可以忽略不计（图8d-8e）。在12天的监测期间，阴性对照组的肿瘤大小持续增加。为了进一步探讨抗肿瘤机制，在不同处理后24 h进行苏木精和伊红（H&E）染色分析和末端脱氧核苷酸转移酶三磷酸尿苷刻痕末端标记（TUNEL）染色。如图所示，H&E染色显示，TPE-BFF TNPs + Laser组和TPE-BFF- d TNPs + Laser组肿瘤细胞均出现严重坏死或凋亡，而其他四组（对照组、Laser组、TPE-BFF TNPs和TPE-BFF- d TNPs组）肿瘤细胞损伤最小。    

总结

我们开发了一种NIR-II发射的AIE集成二氟化硼（BFF）衍生的有机染料（TPE-BFF），具有高光稳定性、高摩尔消光系数（ε = 4.31 × 104 M⁻¹ cm⁻¹）、大Stokes位移、强NIR-II发射和可观的光热转换效率（η = 58.5%）等优越性能。值得注意的是，理论计算表明，精确定制的受体和供体单元对TPE-BFF所需的光物理性质（包括NIR-II荧光成像和光热转换）具有协同作用。利用这些优势和抗糖酵解剂2DG，我们构建了糖酵解调节介导的PTT方法来对抗肿瘤肺转移。在808 nm激光（0.3 W cm⁻²）照射下，释放的2DG降低了ATP的产生和随后的ATP依赖性热休克蛋白，从而降低了肿瘤对PTT的耐热性。通过下调转移相关蛋白，成功实现了对肺癌细胞肺转移的抑制。因此，本研究为构建多功能的NIR-II AIEgens提供了良好的指导，并为整合抗糖酵解药物和AIEgens协同抑制癌细胞转移提供了参考。    

参考文献

 https://doi.org/10.1021/acsnano.4c11527    

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