内容提要
为了克服聚合诱导猝灭和活性氧（ROS）生成能力的减弱，引入了聚合诱导发射（AIE）效应基团来制备近红外AIE光敏剂。然而，目前报道的近红外AIE光敏剂都具有“永远打开”的活性，可能导致全身光毒性副作用。肿瘤微环境可激活的近红外AIE光敏剂尚未报道。在这里，我们开发了一种可活化的近红外AIE PS纳米颗粒（a-NA-PSNP），用于近红外II区（NIR- II）荧光（FL）成像引导的808 nm激发下的PDT。设计了NIR AIE光敏剂（N-PS），并与牛血清白蛋白（BSA）中的半胱氨酸(Cys)/谷胱甘肽（GSH）响应电荷转移复合物（CTC）结合，获得a-NA-PSNP。在BSA中，N-PS表现出高量子产率和光稳定性。作为一种能量受体，CTC可抑制正常细胞和组织中na - na - psnp的NIR-II荧光和ROS生成能力。CTC响应肿瘤微环境Cys/GSH分解，在808 nm光照射下恢复na - na - psnp的NIR-II荧光，高效生成ROS。Cys/ GSH的缺失也调节肿瘤细胞内还原环境，进一步促进PDT。体外和体内实验结果均证实了肿瘤微环境对a-NA-PSNP的选择性和高效激活，提示其在肿瘤治疗中的潜力。
NIR-AIE PS纳米颗粒（NA-PSNP）的制备及其体外表征
化合物N-PS由4,8-二（4-（2-乙基己基）噻吩-2-基）苯并[1,2-c:4,5-c ']二[1,2,5]噻二唑（化合物1）和7-溴-9,9-二乙基- n， n-二（3-甲氧基苯基）- 9h -芴-2-胺（化合物3）合成。N-PS FL在不同水馏分（fw）的THF/H2O混合物中记录，表现出典型的AIE特征，随着混合溶剂中水馏分的增加，FL强度增加。当fw达到90%时，得到的NA-PS的FL强度比在THF溶剂中的N-PS增强了约7.3倍。与N-PS在THF溶剂中的吸收峰相比，NA-PS在90% H2O/THF溶剂中的吸收峰也出现了明显的红移，这进一步证实了NA-PS在90% H2O/THF中的形成。N-PS在超声下与BSA快速混合，生成尺寸约为40.9±5.6 nm的NA-PSNP，水动力直径为64.7±3.5 nm， zeta电位为18.2±0.5 mV。NA-PSNP在730 nm处显示出最大吸收峰，这与NA-PS在90% H2O/THF混合液中的吸收峰相似，说明NA-PS在BSA中高效形成。NA-PSNP在900-1300 nm范围内显示出强烈的NIR-II荧光发射，最大发射峰在1000 nm处。NA-PSNP 270 nm的大Stokes位移降低了背景FL，保证了其在体内成像中的有效应用。NA-PSNP显示出与NA-PS （90% H2O/THF）相似的滤光强度，与N-PS （THF）相比，滤光强度显著增强。以荧光染料IR-26为参考，根据公式计算FL量子产率（QY），其中，QY （sample）为N-PS的QY， S （sample）和S （ref）分别为NPS和IR-26在不同溶液中对808 nm吸光度进行线性拟合得到的斜率。n （sample）和n （ref）分别为H2O和二氯乙烷的折射率。与FL强度增强相对应，QY表现出类似的增加趋势，从N-PS （THF）的0.21%增加到NA-PS （90% H2O/THF）的1.65%和NA-PSNP的2.32%。通过测定1,3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）吸光度和电子顺磁共振（EPR）谱，评价NA-PSNP的体外ROS生成能力。DPBF的吸光度特征在416 nm应对NA-PSNP大幅减少在波长730纳米的激光辐照下10分钟(0.3 W / cm2),而DPBF特征吸收峰保持不变在缺乏NA-PSNP(图S11B),指示效率NA-PSNP PS。NA-PSNP也显示良好的ROS生成能力在808 nm激发DPBF减少69.2%的特征吸收峰在416 nm 10分钟,将与N-PS相同摩尔的ICG包埋在BSA中，制备了ICG- np。所得的ICG-NP具有约43.7±3.2 nm的球形纳米结构，流体动力直径为69.1 nm。ICG-NP在416 nm处的DPBF特征吸收峰在10 min内也有类似的（52.2%）下降图1G， ICG-NP）。通过与临床批准的光敏剂ICG（根据先前的报道，ICG的ROS量子产率Φ为0.2%）进行比较，计算NA-PSNP的ROS量子产率（Φ）， ICG的量子产率为4.47%（图S12），表明NA-PSNP具有更强的ROS生成能力。NA-PSNP也表现出良好的抗光漂白能力，在808 nm照射10 min后具有稳定的吸光度和FL，而在相同条件下，ICG-NP的吸光度和FL明显降低。在808 nm激光照射下，2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮（TEMP）存在时，NA-PSNP显示出典型的1:1:1三重态信号（图S14A），而在808 nm激光照射下，5,5-二甲基-1-吡啶n -氧化物（DMPO）存在时，NA-PSNP未观察到明显的共振信号，表明产生了1 O2和相应的II型PDT。
a-NA-PSNP的制备及其体外研究
通过N-PS或CTC（由TMB和F4TCNQ偶联合成）与白蛋白疏水结构域的疏水相互作用，采用一锅法合成了a- na - psnp。获得的a-NA-PSNP呈球形纳米结构，直径约为52.9±5.3 nm（图S5B），水动力直径为72.3±3.0 nm，在培养基中观察一周后，a-NAPSNP直径稳定在72.0±4.7 nm，表明a-NA-PSNP在体外具有较高的长期稳定性。测定a-NA-PSNP的zeta电位为17.2±0.6 mV，与BSA和NA-PSNP相比几乎保持不变。TMB和F4TCNQ在BSA中偶联生成CTC， CTC在900-1300 nm范围内表现出广泛的NIR-II吸收。CTC作为能量受体，通过共振能量传递过程抑制NA-PS发光，降低ROS生成能力。根据TMB和F4TCNQ的负载量，a-NA-PSNP显示出增强的吸光度和降低的NIR-II FL强度。当TMB/F4TCNQ加载量达到0.8 mM时，na - na - psnp得到了充分的NIR-II FL抑制。获得的a-NA-PSNP几乎没有表现出1 O2生成能力，并且在808 nm激光照射下，DPBF在416 nm处的特征吸光度峰没有任何强度变化。F4TCNQ选择性地与肿瘤微环境中高表达的Cys反应形成单噻唑烷衍生物，从而破坏CTC偶对，相应降低其在NIR-II区的吸光度。随着Cys浓度的增加，a-NA-PSNP的吸光度逐渐降低，相应地导致NIR-II FL逐渐恢复。与NA-PSNP相比，a-NA-PSNP特征发射峰的FL回收率达到91.0%，表明a-NA-PSNP对Cys具有高效的响应敏感性。除Cys外，在肿瘤微环境中高表达的GSH也可以通过切割蛋白质中丰富的二硫键，生成巯基和氨基，与F4TCNQ进行环加成反应来降解CTC。因此，与NA-PSNP相比，用GSH孵育a-NA-PSNP也导致NIR-II吸光度降低（图S17C）， NIR-II FL回收率为86.4%。在987 nm处，A- na - psnp荧光恢复强度与Cys和GSH呈线性关系，线性范围分别为1 ~ 4 mM和1 ~ 8 mM，检出限（LOD）分别为51.26 μM和100.32 μM。
a-NA-PSNP在NIR-II FL成像和PDT中的体内应用
为了追踪纳米探针的体内循环，静脉给药“always on”探针NA-PSNP，在808 nm激光照射下立即观察NIR-II FL信号随血流的传播，以显示全身血管结构。在给药后4小时开始显示NA-PSNP的肿瘤积累（图3A， NA-PSNP，肿瘤小鼠）。通过静脉注射a-NAPSNP给药4t1 -荷瘤BALB/c小鼠，证实了a-NAPSNP的肿瘤特异性激活，并在给药后4小时从肿瘤生长位置（图3A， a-NA-PSNP，肿瘤小鼠）观察到NIR-II FL，邻近正常组织清晰的背景。在健康小鼠的相应位置几乎观察不到NIR-II FL（图3A a-NA-PSNP，健康小鼠）。体内NIRII FL在a-NA-PSNP和NA-PSNP给药小鼠组均表现出时间依赖性增加，并在给药后48 h达到最大强度。在体内，由于来自肿瘤组织的纳米探针的代谢，FL强度逐渐降低。与NA-PSNP给药小鼠相比，a-NA-PSNP给药小鼠在荷瘤小鼠中显示出更高的信噪比，表明a-NA-PSNP对PDT的非特异性激活和光毒性具有良好的保护作用）。与NIR-II FL的变化趋势相似，a-NA-PSNP给药组肿瘤生长部位的信噪比呈时间依赖性增加，在给药后48 h达到最大值10.6。尽管显示出相似的体外肿瘤荧光，但a-NA-PSNP给药组和NA-PSNP给药组的信噪比值不同。a-NA-PSNP在邻近正常组织中保持低荧光强度，导致Fb值较低，信噪比较高。NA-PSNP作为“常亮”探针，在邻近正常组织中表现出高荧光强度，导致Fb值高，信噪比低。a- na - psnp的信噪比值为5，作为100%确定区分图像特征的主要标准，它提供了24至96小时的长期成像和治疗窗口。在给药96 h后收集给药NA-PSNP和a-NA-PSNP的健康小鼠和荷瘤小鼠的器官，结果显示，给药a-NA-PSNP小鼠肿瘤部位的NIR-II FL强度较强，表明纳米探针的肿瘤微环境特异性激活。肝脏中GSH的高表达（5 mM）也导致a-NA-PSNP给药的肿瘤小鼠和健康小鼠的肝脏中有足够的NIR-II FL恢复。由于纳米探针的积累，给药始终开启探针NA-PSNP的荷瘤小鼠在肿瘤和肝脏部位显示出相似的NIR-II FL。
通过静脉给药BALB/c 4T1荷瘤小鼠，验证了a-NA-PSNP在肿瘤微环境中作为AIE PS的体内活化。根据体内NIR-II成像，a-NA-PSNP在给药后48小时在肿瘤位置显示最强的FL，这引导了808 nm激光照射（0.3 W/cm2, 15 min）进行PDT的时间点。为评价治疗效果，将4T1荷瘤小鼠分为6组，分别给予1：生理盐水；2: na-psnp ）；3: a-NA-PSNP （a-NA-PSNP，）；4：仅激光照射（生理盐水，近红外（+））；5: napsnp激光治疗组（NA-PSNP, NIR (+)）；6: a-NA-PSNAP激光治疗组（a-NA-PSNAP， NIR(+)）。治疗过程中进行两次给药和PDT，第15天采集肿瘤。NIR激光照射小鼠NA-PSNP和a-NA-PSNP组均能有效抑制肿瘤生长，打破细胞内氧化-氧化还原平衡，促进PDT，表现出较好的治疗效果。无近红外激光照射的a-NA-PSNP给药小鼠组也表现出一定程度的肿瘤生长抑制，主要是由于Cys/GSH耗竭导致氧化还原平衡被破坏。。仅用NIR激光照射的小鼠组几乎没有显示出治疗效果，并且肿瘤大小与生理盐水和NA-PSNP给药小鼠组相似。收集的肿瘤表现出与肿瘤体积曲线相似的趋势。
总结
我们合成了一种用于肿瘤治疗的近红外AIE光敏剂N-PS。在BSA中聚合态下，N-PS的荧光量子产率为2.32%，ROS量子产率为4.47%，具有良好的光稳定性。N-PS与白蛋白（BSA）中的Cys/GSH响应电荷转移复合物（CTC）结合，获得可活化的NIR-II荧光成像和PDT光疗探针a-NA-PSNP。CTC作为一种能量受体，猝灭了正常组织中na - na - psnp的NIR-II荧光和ROS产生能力，对na - na - psnp的非特异性活化提供了良好的保护作用。CTC在肿瘤微环境中响应Cys/GSH被分解，因此在808 nm光照射下恢复了a-NAPSNP的NIR-II荧光，并高效生成ROS。体外和体内实验结果均证实了a-NA-PSNP在肿瘤微环境中的选择性和高效激活，提示其在肿瘤精准诊断和治疗方面的潜力。
参考文献
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2024.122918
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