内容提要
Aza-BODIPYs是一类由硼原子固化和稳定π共轭体系的荧光团。增强其荧光特性的一个很有前途的策略是用金属离子取代硼原子。在这里，我们描述了一种水溶性衍生物的合成和表征，其中金属是镓(III)离子，称为WazaGaY(水溶性aza-GaDIPY)。水溶性是由两个铵取代基保证的，与二甲胺类似物相比，诱导了色移和量子产率的显着增加。在不同的肿瘤细胞中观察了WazaGaY-1的细胞行为。在体内，确定了分布和安全性，并评估了不同肿瘤类型的肿瘤摄取。在静脉注射后，即使在没有特异性结合的情况下，WazaGaY-1也能在具有高肿瘤与肌肉比率（从7到20）的小鼠中清晰地识别皮下植入的肿瘤。其作为荧光引导手术造影剂的潜力得到了证实。
通过优化我们之前发表的方法合成了含有二甲氨基基团azaGaDIPY- nme2的azaGaDIPY配合物通过季铵化两个二甲胺基团，提高了在水介质中的溶解度。它在水介质中的溶解度高达150 μM，因此我们将其命名为WazaGaY-1，即水溶性azaGaDIPY。为了量化这种改善，用hplc估计了azaGaDIPY-NMe2复合物和wazagadipy - nme2复合物的logP值。15 azaGaDIPY-NMe2复合物的logP值为3.1，而WazaGaY-1复合物的logP值为1.6，表明水溶性得到了非常显著的改善。吸电子基团(NMe3+)的存在，而不是给电子基团(NMe2)，它们具有非常相似的绝对哈米特常数(|+0.82| vs |−0.83|)，对最大吸收波长没有显著影响，但与苯基衍生物相比，它们都有强烈的红移(λem = 728 nm)然而，转化为铵态光引起了最大发射波长(+10 nm)的轻微色移和量子产率的显著提高。
在小鼠血清中稀释化合物后，研究了WazaGaY-1在NIR-I和NIR-II中的光学性质。虽然在685 nm激发和720±20 nm收集（后称为700 nm条件）后，WazaGaY-1几乎不发光，但在785 nm激发和820±20 nm收集（后称为800 nm条件）后，其荧光被很好地检测到。这与之前记录的吸收光谱和观察到的光物理性质是一致的。在808 nm激发后，WazaGaY-1也表现出NIR-II荧光，主要是在1064 - 1700 nm范围(后来称为1064 nm条件)的发射集合中观察到的。在730/750 nm附近激发可以进一步优化这种荧光，这对应于化合物的最大吸收。在NIR-I和NIR-II条件下，荧光随着化合物浓度的增加而增加，直到达到平台。这样的平台可以归因于分子的自组装，它可以部分地淬灭荧光信号或有利于其沉淀。此外，WazaGaY-1荧光也在各种培养基中进行了检测，包括PBS、白蛋白和含有生理或富集脂蛋白含量的人血浆。在NIR-I和NIR-II光学窗口中，与人血浆相比，PBS中的荧光非常低，白蛋白存在时荧光中等。有趣的是，在富集的血浆中，即低密度脂蛋白水平高的血浆中，荧光增强，和其他azaBODIPY化合物一样这一观察结果可能支持了WazaGaY-1与血浆脂蛋白相互作用的假设，这种相互作用可以增强染料在生物条件下的荧光特性。
在体外研究了WazaGaY-1的行为。首先通过测量内皮HUVEC、胶质母细胞瘤U87MG和肾HEK293三种二维培养的人细胞系的代谢活性来评估其细胞毒性。将WazaGaY-1浓度从0.1 μM增加到50 μM，细胞活力保持在85%以上，表明该化合物在该浓度范围内没有毒性。在最高剂量100 μM时，HEK293细胞有一定的细胞毒性。因此，采用10 μM溶液研究WazaGaY-1在U87MG和HEK293细胞中的体外分布。对球状体培养的U87MG细胞进行了类似的实验。细胞存活率保持在85%以上，与二维培养一致，最高浓度下坏死细胞百分比低于2.5%。与对照条件相比，100 μM的WazaGaY-1的存在显著减小了球体的尺寸，达到对照条件下测量尺寸的50%;当含有10 μM的WazaGaY-1时，球体尺寸达到控制条件之一的85%。研究WazaGaY-1的细胞内化。将肿瘤细胞与WazaGaY-1孵育30 min ~ 24 h，流式细胞术检测肿瘤细胞荧光。在这两种细胞系中，荧光信号随着时间的推移而增强。孵育30min后，所有细胞均呈现荧光;然而，与HEK293细胞相比，U87MG细胞显示出更高的荧光信号，表明该化合物在该细胞系中积累更高。用共聚焦显微镜证实了这一观察结果。用WazaGaY-1孵育U87MG和HEK293细胞，并用Hoechst试剂反染鉴定细胞核。孵育1小时后，U87MG细胞细胞质内出现了大量的WazaGaY-1积累，并且这种积累随着时间的推移而增加。HEK293细胞也在细胞质中积累了WazaGaY-1，但程度较轻。将U87MG细胞培养成球形，模拟微肿瘤，观察WazaGaY-1在其中的分布。孵育1h后，在球体核心检测到WazaGaY-1，其积累量随时间增加。
为了更好地了解这种新分子的细胞内化途径，在FACS分析之前，将U87MG细胞与WazaGaY-1在4°C或37°C下孵育0.5 - 4小时。在4℃时，进入细胞的主动转运停止，这意味着荧光信号与粘附在细胞膜上的分子和被被动扩散内化的分子有关。如图所示，在4°C时荧光信号相对较弱，而在37°C时荧光信号明显增强，说明参与了主动转运机制，使WazaGaY-1在细胞内高效积累。一种潜在的主动运输机制被称为内化由网格蛋白包覆的凹坑介导
研究了WazaGaY-1在小鼠皮下U87MG肿瘤中的体内行为。首先，使用无创荧光成像和离体荧光定量测定切除器官的最佳剂量。动物在静脉注射25、50和100 μg的WazaGaY-1之前和几小时后成像。如图所示，在相似的暴露时间点和对比度调整下，在注射后5至72 h，所有三种剂量的U87MG肿瘤都被检测到(通过测量800 nm的荧光强度)。在体内，荧光信号在皮肤中检测到最高剂量，并随着时间的推移而减弱。为了评估肿瘤与周围组织的对比，记录肿瘤与同一对侧区域的荧光信号。如图所示，肿瘤与周围组织之比在5 ~ 24 h期间升高，并稳定至72 h。24 h后，这些体内肿瘤与周围组织之比略高于2，在四个时间点上三种剂量之间无统计学差异。在72 h时还研究了肿瘤与健康组织比率的离体评估。这些比率在25和50 μg之间相似，但在最高剂量100 μg时增加。肿瘤与皮肤的比值在3到7.6之间，肿瘤与肌肉的比值在14.4到20之间，肿瘤与脂肪的比值在13到28.7之间。对于后者，100 μg剂量组的这一比例显著高于25 μg (p = 0.002)和50 μg (p = 0.014)剂量组。这些比率允许肿瘤的清晰识别，这是必不可少的荧光引导手术应用。
总结
我们报告并评估了一种新的aza-BODIPY衍生物的生物学特性，其中硼原子被镓离子取代。这种新分子被命名为WazaGaY-1，是一种NIR-1荧光、水溶性和生物相容性分子，其最大发射波长为820 nm.14这种分子也可以用于NIR-II成像，尽管亮度有限。与其他荧光染料相比，WazaGaY-1具有高度的光稳定性，这对于长时间的外科手术来说是一种极好的特性。在为图像引导手术开发的荧光低分子量染料中，有几种染料的血清半衰期缩短，在给药和手术之间需要较短的时间，如ICG。相反，免疫偶联探针（如西妥昔单抗偶联探针）在抗体介导下具有非常长的血清半衰期，在注射和手术之间需要几天的时间间隔才能获得相关的肿瘤-周围组织对比。WazaGaY-1具有4.8小时的中间血清半衰期，在体内维持稳定的肿瘤与周围组织比率在5至72小时之间。这种延长的半衰期可能归因于WazaGaY-1与脂蛋白的可能相互作用，正如已经观察到的类似的基于azabodip的分子此外，在NIR-I窗口中，肿瘤与肌肉或肿瘤与脂肪的对比随肿瘤类型的不同而变化，在我们的实验中，肌肉的相关比为7到20，与脂肪的相关比甚至更高。这些数值超过了文献中报道的分子探针34，这表明WazaGaY-1可以有效地用于各种肿瘤类型的荧光引导手术。
参考文献
https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.4c01435
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