内容提要
本文提出了一种新的“电子给体迭代”策略，构建具有给体-πacceptor-π-donor （D-π-A-π-D）特征和双自由基特征的有机光热枝状大分子(CR-DPA- t、CR-（DPA)2-T和CR-(DPA)3-T）。由于增强的D-A效应和分子内运动，它们的吸收和光热容量随着代数的增加而增加。CR-(DPA)3-T纳米颗粒（CR-(DPA)3-T NPs）在NIR-II区具有优异的光热性能（[1064 × PTCE1064]），其值为2.85 × 104。此外，CR-(DPA)3-T NPs通过光热治疗（PTT）和免疫治疗的协同作用，显示出优越的抗肿瘤效果，有效抑制原发肿瘤和远处肿瘤的生长。
通过将给电子的树突状DPA单元连接到噻吩取代的CR上，进行电子给体迭代策略，设计了树状结构的CR衍生物CR-DPA- t、CR(DPA)2-T和CR-(DPA)3-T。在树突分子结构内，DPA单元的数量逐渐增加，增强了它们的电子给能，并建立了引人注目的分子间空间隔离，这将诱导强烈的D-A相互作用以进行色移吸收，并通过可旋转的DPA和甲氧基单元促进分子内运动。与CR-DPA- t类似，CR-(DPA)2-T和CR(DPA)3-T的电子自旋共振（ESR）谱显示，它们也具有双自由基特征。如图所示，在DCM溶液中可以清晰地观察到CR-(DPA)2-T和CR-(DPA)3-T的ESR信号，其对应的g值分别为2.0037和2.0032。随着温度的升高，它们的ESR信号逐渐增强，单重态-三重态能隙（ΔEST）分别为−0.7232和−1.2999 kcal mol−1。如此小的ΔEST允许在室温下热诱导三态激发态。这些结果证明了单线态双自由基的典型特征。为了进一步了解CR-(DPA)2-T和CR-(DPA)3-T的双自由基特征，在uHF/6311g（d,p）水平上进行了密度泛函理论计算。CR-(DPA)2-T和CR(DPA)3-T获得的最高已占分子轨道（HOMO）曲线显示出明显的不相交特征，并且CR-(DPA)2-T和CR-(DPA)3-T（蓝色和绿色表面）的分离自旋密度大多在共面噻吩取代的CR核内离域，表明其具有双自由基特征，双自由基特征y分别为0.5822和0.5604。因此，成功地获得了具有双自由基特征的有机树状大分子。然后，收集CR-DPA- t、CR(DPA)2-T和CR-(DPA)3-T在四氢呋喃（THF）溶液中的紫外-可见-近红外吸收光谱。CR-DPA- t、CR-(DPA)2-T和CR-(DPA)3-T的吸光度最大值分别位于850、910和930 nm处。与先前报道的CR-DPA- t相比，CR-(DPA)3-T的吸收最大值红移了约80 nm，这可能归因于通过迭代DPA基团增强了D-A相互作用。通过常见的纳米沉淀法将这些CR衍生物制备成纳米颗粒(CR-DPA- t NPs, CR-（DPA)2-T NPs和CR-(DPA)3-T NPs）。一种两亲性共聚物，1,2-二硬脂酰-sn-甘油-磷酸乙醇胺- n-[甲氧基（聚乙二醇）-2000](DSPE-mPEG2000)，被用来提高纳米颗粒的稳定性和延长血液循环。使用预先建立的校准吸收曲线来确定纳米颗粒的浓度。CR-DPA- t NPs、CR-(DPA)2-T NPs和CR-(DPA)3-T NPs的尺寸分别为≈128.3、91.6和123.7 nm，这有利于通过增强渗透性和滞留（EPR）效应在肿瘤中积累这些NPs。通过透射电子显微镜（TEM）确定CR-(DPA)3-T NPs的形态为分散的球形纳米颗粒。树状大分子中DPA单元数量的增加使得空间隔离效果显著，从而促进分子内运动，这有利于光热转换。这促使我们对CR-DPA- t NPs、CR-(DPA)2-T NPs和CR-(DPA)3T NPs的光热性质进行了评价。为了直接比较它们的光热性能，我们考虑了这些纳米粒子的nir - ii吸收能力。CR(DPA)3-T NPs （120 μg mL−1）首先在1064 nm激光照射下进行光热行为研究。CR(DPA)3-T NPs表现出与功率密度相关的光热转换特性。随着功率密度的增加，温度明显升高（最高可达60.6℃）。然后，在1064 nm激光（1.0 W cm−2）的照射下，研究了CR-(DPA)3-T纳米粒子的浓度效应，温度随着纳米粒子浓度的增加而增加。所有这些温度变化都通过红外热像仪清晰地显示出来。然后在相同的条件下对CR-DPA- t NPs和CR-(DPA)2-T NPs的光热性能进行了评价，同样表现出良好的温升曲线。
鉴于CR(DPA)3-T NPs具有显著的光热特性，我们对其光热体外抗癌活性进行了评价。首先采用CCK-8法检测CR-(DPA)3-T NPs的光毒性。如图所示，在高达120 μg mL−1的浓度下，CR-(DPA)3T NPs在黑暗中表现出可以忽略不计的细胞毒性，细胞存活率在90%以上，证明了其良好的生物相容性。在1064 nm （1.0 W cm−2）激光照射下，不同浓度的CR-(DPA)3-T NPs孵育4T1细胞后，细胞活力明显下降，在120 μg mL−1浓度下，细胞活力仅为≈11%，说明激光照射后CR-(DPA)3-T NPs对4T1细胞有杀伤作用。然后，我们通过活细胞/死细胞染色分析进一步研究了CR-(DPA)3-T NPs的PTT性能。Calcein-AM（绿色）和碘化丙啶（PI，红色）分别对活细胞和死细胞进行荧光染色。在对照、激光和NPs组中，观察到绿色荧光的完整视图，表明它们的细胞活力高。相比之下，在1064 nm激光照射（1.0 W cm−2,10 min）后，NPs + Laser组大量经CR-(DPA)3-T NPs （120 μg mL−1）处理的4T1细胞被红色荧光染色，证实了CR-(DPA)3-T NPs优异的PTT性能。通过流式细胞术评估CR-(DPA)3-T NPs对肿瘤细胞的PTT作用。对照组、激光组和NPs组的细胞毒性无显著差异。而NPs + Laser组的凋亡细胞比例由对照组的9.73%上升至42.37%，表明CR-(DPA)3-T NPs具有一定的光毒性。这些结果证明了CR-(DPA)3-T NPs在体外具有较高的PTT疗效，为体内光热治疗奠定了坚实的基础。
在PTT过程中，ICD被激活并诱导肿瘤相关抗原暴露于抗原提呈细胞并刺激肿瘤免疫原性，[8]可通过检测损伤相关分子模式，如三磷酸腺苷（ATP）、钙网蛋白（CRT）和高迁移率组盒1 （HMGB-1）来评估。这些标记物的释放可以激活抗原呈递细胞，如巨噬细胞和树突状细胞，促进T细胞对残余和转移性肿瘤的免疫反应。如图所示，CR-(DPA)3-T NPs （120 μg mL−1）和1064 nm激光照射（1.0 W cm−2,10 min）处理4T1细胞的ATP释放量显著高于激光或NPs单独处理的细胞，是对照组的近12倍。同时，对NPs和激光处理后的4T1细胞进行免疫荧光染色后，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）可以清楚地观察到CRT在细胞膜上的积聚和HMGB-1从细胞核中扩散。HMGB1可以在各种应激条件下从细胞核迁移到细胞质，最终迁移到细胞外。结果表明，CR-(DPA)3-T nps3介导的PTT可有效诱导4T1细胞ICD。
我们进一步评估了CR-(DPA)3-T NPs在体内的光热免疫治疗效果。通常，良好的光热效应伴随着良好的光声性能。如图所示，体外测量CR(DPA)3-T NPs的PA图像，PA信号强度随CR-(DPA)3T NPs浓度呈线性上升，表明其在体内定量CR-(DPA)3-T NPs的可行性。在对肿瘤进行光热免疫治疗前，采用PAI定量测定4T1荷瘤小鼠肿瘤部位CR-(DPA)3-T NPs的富集程度，确定最佳治疗窗口。经尾静脉注射CR-(DPA)3-T NPs （250 μ mL ~ 1200 μL）后，肿瘤部位PA信号强度逐渐升高，表明CR-(DPA)3-T NPs通过EPR效应在肿瘤部位有效积累。12 h后，信号达到最大值，然后开始减弱。因此，在NPs给药后12小时进行肿瘤治疗。为了研究CR-(DPA)3-T NPs对4T1荷瘤小鼠的光热作用，我们通过热像仪监测了4T1荷瘤小鼠静脉注射CR(DPA)3-T NPs的肿瘤温度。1064 nm激光（1.0 W cm−2）照射15 min后，静脉给药CR-(DPA)3-T NPs (700 μ mL−1200 μL) 12 h后，小鼠肿瘤温度上升到≈47℃，而单独激光处理小鼠肿瘤温度仅上升到≈39.7℃。这些结果清楚地证明了CR-(DPA)3-T NPs在NIR-II pai引导的PTT肿瘤消融中作为令人印象深刻的光热剂的可行性。
我们采用双侧4T1皮下肿瘤小鼠模型，通过监测15天的原发肿瘤和远处肿瘤的生长情况，进一步研究CR-(DPA)3T nps介导的NIR-II PTT的疗效和免疫治疗的抗肿瘤效果。首先，将4T1只荷瘤小鼠随机分为PBS组、Laser组、NPs组和NPs + Laser组。在治疗第1、3、5天，向4T1荷瘤小鼠尾静脉注射CR-(DPA)3- t NPs （NPs + Laser组分别为700 μ mL ~ 1200 μL）。12 h后，用1064 nm激光（1.0 W cm−2）照射原发肿瘤15分钟。在15天的治疗过程中，每2天仔细记录小鼠的体重和原发肿瘤和远处肿瘤体积。PBS、Laser、NPs三组肿瘤的生长速度相似，原发肿瘤和远处肿瘤的平均体积分别增加了5 - 7倍和6 - 8倍。相比之下，在NPs + Laser组中，原发肿瘤和远处肿瘤的生长都得到了有效抑制，原发肿瘤和远处肿瘤的肿瘤生长抑制率分别为87.07%和64.39%。在15天的治疗期间，大鼠的体重没有明显变化，这表明CR-(DPA)3-T NPs （700 μ mL -1、200 μL）和1064 nm激光（1.0 W cm - 2）都没有引起毒性。此外，我们进一步通过苏木精和伊红（H&E）染色对小鼠主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）的病理毒性评价。NPs + Laser组未见明显组织学异常，说明NPs具有较高的生物相容性。此外，H&E染色和tdt介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色显示，NPs + Laser组原发性和远处肿瘤细胞的凋亡和坏死比其他三组（PBS、Laser和NPs组）更严重。之后，通过Ki67染色评估各组肿瘤细胞的增殖情况，NPs + Laser组的原代和远端肿瘤细胞的增殖速度比对照组慢。以上结果表明，CR-(DPA)3-T NPs具有较强的光热活性，能有效地消融原发肿瘤，抑制远处肿瘤的生长。
总结
基于一种新颖的电子给体迭代策略，设计合成了三种具有D-𝜋-A-𝜋-D结构和双自由基特性的CR-(DPA)2-T、CR-(DPA)2-T和CR-(DPA)3-T有机光热枝状大分子。协同的D-A效应和丰富的分子内运动有效地促进了NIR-II区的吸收和光热转化。由于DPA数量的增加，CR-(DPA)3-T在930 nm处表现出最大的吸收峰，其纳米颗粒表现出较宽的吸收区（700 ~ 1300 nm）。值得注意的是，CR-(DPA)3-T NPs的ε 1064 （4.722 × 104 L mol−1 cm−1）和PTCE1064（60.4%）均表现优异，达到破纪录的ε 1064 × PTCE1064 （2.85 × 104）。CR(DPA)3-T NPs出色的光热性能使其能够在体外和体内实现高效的pai引导NIR-II PTT。同时，PTT引起的有效ICD可诱导癌细胞释放肿瘤相关抗原TNF- rtp和IFN<2>
