内容提要
本文通过乙烯基桥接羟基二苯基黄嘌呤单元和苯并[cd]吲哚骨架，合理设计了智能第二近红外窗口（NIR-II）分子（BITX-OH），用于诊断和治疗。BITX-OH对黏度有很高的选择性和敏感性，在962 nm处对NIR-II荧光有显著增强（1167倍）。在BITX-OH和NIR-II荧光成像的帮助下，成功地实现了非酒精性脂肪肝（NAFL）的早期诊断和治疗评价，以及活体小鼠肝纤维化（HF）的现场实时监测。BITX-OH在808 nm激光照射下表现出优异的光热转换效率，可以诱导肿瘤消融并增加黏度，从而增强NIR-II荧光，用于实时评估光热治疗（PTT）。
BITX-OH的合成以及对粘度的光谱响应
分子BITX-OH是通过巧妙地结合对羟基二苯基黄嘌呤（作为强电子供体，D）和苯并[cd]吲哚-1-ium（作为电子受体，A）和双键𝜋-bridge骨架而设计的。这种D-π-A结构通常具有很强的推拉效应，使BITX-OH具有NIR-II荧光和较大的Stokes位移。对羟基二苯基黄嘌呤除了作为电子供体外，还可以作为分子转子，提供多个可自由旋转的单键，使分子在低粘性介质中处于扭曲的分子内电荷转移（TICT）状态，有助于光激发时消耗激发能。随着黏度的增加，这些化学键的旋转可能受到限制，导致荧光发射增强。更重要的是，高D-A强度和自由分子旋转可以在光激发时有效地促进非辐射衰变，从而产生非凡的热量，这使得BITX-OH在PTT应用中具有前景。为了表征BITX-OH对粘度的响应，我们分别研究了BITX-OH在水和甘油中的光谱特性。在低黏度水溶液中，BITX-OH在730 nm附近的吸光度最大（1.42 × 104 M−1 cm−1）；而在99%甘油溶液中红移至830 nm (4.54 × 104 M−1 cm−1)），这是因为在高粘度溶剂中形成了更多的平面构象。为了系统地研究BITX-OH的粘度响应性，我们随后通过将甘油分数（fG）从0调整到99%，测量了不同粘度水平的水-甘油混合物中的荧光光谱。在808 nm激发下，在绝对水中只记录到非常微弱的荧光发射，这可能是由于多个可旋转的单键使BITX-OH处于TICT状态，导致激发态发生非辐射衰减，从而导致荧光猝灭。当粘度水平从0.89 cP （fG = 0%）增加到945 cP （fG = 99%）时，BITX-OH在900-1400 nm范围内的发射逐渐增加，荧光图像增强，非常适合在NIR-II区域进行粘度成像。同时值得注意的是，在962 nm处最大荧光强度的变化甚至超过了1167倍，比目前报道的NIR-II黏度分子灵敏得多。[13]此外，测得BITX-OH在水中的荧光量子产率（Φf）为0.004%，在甘油中的荧光量子产率高达0.035%（相对于IR-26，在1,2 -二氯乙烷中Φf = 0.5%）。[12d，m] BITX-OH的这种粘度敏感特性可归因于单键旋转受限和高粘度环境下分子的TICT受到抑制。生物系统中活性物质的多样性和微环境的复杂变化（如pH、局部极性等）可能会影响BITX-OH对粘度的响应。然后研究了其他潜在干扰物质（如丰富的蛋白质、常见金属离子和氨基酸）存在时BITX-OH的荧光光谱。令人鼓舞的是，只有99%的甘油能引起显著的荧光增强，这表明BITX-OH对粘度有很高的选择性。此外，与99%甘油体系中的荧光增强相比，BITX-OH在DMSO、MeOH、丙酮、DCM、DMF、CH3CN、THF、甲苯、1,4-二恶烷和水等不同极性溶剂中的荧光变化可以忽略。通过在含有0和95%甘油的不同pH水平的PBS中记录发射光谱，进一步测试了pH对BITX-OH的影响。正如预期的那样，在3.0-10.0的pH范围内，BITX-OH的荧光强度基本保持恒定。综上所述，上述结果表明BITX-OH对微粘度波动具有高度选择性，具有灵敏检测复杂生物系统粘度的潜力。BITXOH的粘度传感性能，特别是在高灵敏度响应（1167倍）和宽线性范围（1.15-945 cP）方面明显优于其他已有报道的分子，这非常有利于实时检测生物系统中的微粘度波动。
BITX-OH在体内粘度变化的可视化
受BITX-OH在体外良好的黏度敏感特性的启发，我们利用NIR-II荧光成像技术研究了其在不同药物刺激下的体内黏度响应能力。据报道，制霉菌素（Nys）或莫能菌素（Mon）可诱导线粒体结构改变和/或肿胀，导致线粒体功能障碍，通常伴有粘度波动。为此，在小鼠右腿肌内注射Nys或Mon，然后注射BITX-OH；左腿注射生理盐水和BITX-OH作为对照。如图所示，对照组腿部区域发出不明显的荧光；然而，Nys和Mon处理的腿部区域显示NIR-II荧光分别增强了1.61倍和1.72倍，表明Nys或Mon刺激后粘度增加。另一种改变黏度的小鼠模型是通过肌肉注射脂多糖（LPS）建立的，已被证实能诱导炎症并增加黏度。可以预见的是，与对照组相比，lps处理的腿部区域的NIR-II荧光信号上升了1.87倍。这些结果表明，BITX-OH可作为一种有效的NIR-II荧光成像工具监测体内粘度变化，在粘度相关疾病的诊断中具有潜在的临床应用前景。
BITX-OH在NAFL体内的影像引导诊断与治疗评价
采用高脂饲料喂养加地塞米松注射3 ~ 9 d的方法建立NAFL小鼠模型，以正常饮食小鼠为对照组。此外，n -乙酰半胱氨酸（NAC，一种具有抗氧化和解粘作用的肝保护剂，可有效减轻肝损伤）被用于治疗9天NAFL组的NAFL小鼠。饲喂3、6、9 d后，分别测定肝脏AST、ALT、TC、TG等生化生理指标。与对照组小鼠相比，NAFL小鼠的生物标志物水平随着喂养天数的延长逐渐升高，而NAC能够有效降低其水平，表明高脂肪饮食会对肝脏造成损害。随后，立即分离NAFL和对照肝器官，石蜡包埋进行HE染色。与离体对照的深红色肝器官相比，NAFL组肝脏增大，肉色，边缘油腻。HE染色进一步证实了NAFL模型的成功建立，模型表现为肝细胞肿胀、空泡化，肝索紊乱，提示脂肪病变严重。同时，nac治疗的NAFL小鼠症状明显缓解。此外，NAFL小鼠的肝脏指数（肝重/体重）明显升高，NAC具有一定的缓解作用。然后，对照组、NAFL组（3-9天）和NAC+NAFL组（9天）小鼠静脉注射BITX-OH进行NIR-II荧光成像。注射后5min，肝脏可检测到BITX-OH的NIR-II荧光信号，随着给药时间的延长，该信号逐渐增强，肝脏损伤与荧光强度呈正相关。值得注意的是，随着肝损伤的进展，相应的黏度水平不断增加，BITX-OH可以通过NIR-II荧光成像监测肝脏黏度变化，快速、灵敏地区分不同程度的NAFL。此外，nac处理的小鼠肝脏荧光强度较NAFL组弱，说明肝损伤的缓解伴随着黏度水平的降低。BITX-OH可通过记录肝脏黏度变化，有效监测这一现象，为药物干预改善NAFL的体内观察提供支持。注射后60 min处死小鼠，分离肝脏进行离体荧光成像。与体内成像结果一致，NAFL组离体肝脏NIR-II信号随着NAFL的进展而增加，NAC可以缓解小鼠的NAFL。
BITX-OH的体外光热性质
光热转换效率（PCE）是评价光敏剂PTT性能的重要参数。在此，通过监测不同浓度和功率密度下温度随时间的升高，仔细探索了BITX-OH的光热性能。如图所示，当暴露在808 nm激光照射下时，BITX-OH在DMSO中的温度迅速升高，表现出浓度和功率密度依赖的行为。相应地，红外热图像也与BITX-OH浓度和激光功率密度呈正相关，表明热的产生可以被精确控制。其中，当功率密度大于1.5 W cm−2时，6 min后温度超过45.2℃，可引起热疗（43℃以上），诱导肿瘤凋亡或坏死。值得注意的是，在连续激光照射下至少加热和冷却五圈后，BITXOH几乎没有降解，表明其具有出色的光热稳定性。此外，BITX-OH的光热温度（100 μM, 2.0 W cm−2,10 min）可达到60.5℃，PCE为55.3%，表明BITX-OH具有良好的光热转换效率。这些结果表明，BITXOH是一种很有前途的癌症光治疗剂。
自我监测策略实时评价PTT体内疗效
受PTT对癌细胞的有效消融能力的鼓舞，BITX-OH进一步用于异种移植HeLa荷瘤裸鼠体内PTT应用。瘤内注射BITX-OH （300 μM， 100 μL/200 mm3肿瘤）后，肿瘤区域的荧光信号随着时间的推移逐渐增强，这可能是由于肿瘤病变处的高粘度水平照亮了BITX-OH的NIR-II荧光。荧光强度在注射后2 h达到最大，即使在注射后24 h仍然可见。同时，小鼠其他部位几乎未观察到荧光发射，离体成像结果进一步证实了这一点。这说明BITX-OH具有很强的肿瘤保留能力，副作用可以忽略不计，这对于减少治疗过程中光敏剂的注射次数是非常有利的。基于BITX-OH在体外良好的光热转化效率，我们进一步研究了其在体内的PTT治疗效果。在瘤内注射BITX-OH或生理盐水2 h后，分别用或不用808 nm激光（1 W cm−2）照射小鼠肿瘤区域，监测温度变化5 min。如图所示，“BITX-OH +激光”组肿瘤温度显著升高至55℃；而“生理盐水+激光”组仅升高了5°C，未经激光照射的“BITX-OH”组几乎没有变化。结果表明，BITX-OH在体内具有有效的光热转化，不同的照射时间导致不同的治疗效果。受体内高粘度敏感性和令人满意的PTT放射时间依赖性治疗效果的启发，我们随后探索了BITX-OH通过基于粘度的NIR-II荧光成像实时评估治疗效果的潜力。在瘤内注射BITX-OH或生理盐水（作为对照）2 h后，用808 nm激光（1 W cm−2）照射小鼠肿瘤病变，照射时间分别为1、2和5 min，然后立即在不同激光照射次数下进行荧光成像。令人惊讶的是，随着激光照射时间的延长，BITX-OH组的NIR-II荧光信号逐渐增强，在照射后5min的荧光增强是0 min的约1.7倍，这可能是由于ptt诱导的肿瘤消融过程中黏度水平增加所致。这表明基于黏度的NIR-II荧光强度与照射时间和肿瘤消融程度呈正相关，使BITX-OH能够立即评价PTT疗效。通过监测实验组“BITX-OH + Laser”以及平行对照组“Saline + Laser”和“BITX-OH”的肿瘤体积变化，系统地进行BITX-OH治疗。鉴于BITX-OH良好的肿瘤保留能力，在16天的治疗期内，“BITX-OH +激光”组小鼠仅在瘤内注射一次BITX-OH，然后在注射后2 h用808 nm激光（1 W cm−2,5 min）照射。每隔3 d测量各组小鼠肿瘤体积和体重。如图所示，对照组肿瘤生长迅速，说明单独使用808 nm激光或单独使用BITX-OH均不能抑制肿瘤生长。相反，经过两次808 nm激光照射后，“BITX-OH +激光”组的肿瘤在第13天几乎消失，表明BITX-OH在体内的PTT疗效突出。值得注意的是，热疗引起的烧伤在16天内逐渐愈合，表明BITX-OH具有很高的生物安全性，是临床治疗PTT的一个很有希望的候选光敏剂。PTT处理后，实验组小鼠与对照组小鼠的体重变化无明显差异，进一步说明BITX-OH具有良好的体内生物相容性。
总结
我们合理设计并便捷合成了一种黏度敏感的NIR-II分子BITX-OH，用于肝损伤的早期诊断和PTT体内疗效的实时监测。由于强D-𝜋-A结构和分子内可旋转特性，BITX-OH对黏度表现出1167倍的NIRII荧光增强，可能是目前最敏感的NIR-II黏度分子。利用BITX-OH，通过NIRII荧光成像成功地实现了对NAFL不同程度的准确区分和疗效评价，以及对活鼠HF的有效诊断，揭示了肝损伤时黏度水平的升高。此外，在808 nm激光照射下，具有高粘度敏感性的BITX-OH也表现出优异的光热转换效率，可以诱导黏度增加的细胞死亡，从而增强NIR-II荧光，作为实时PPT治疗反馈。更重要的是，在活体小鼠中实现了PTT诱导的肿瘤消融和基于黏度的治疗反馈，使BITX-OH具有自我监测PTT疗效的功能，以避免治疗不足或过度。因此，本研究成功地提出了一种非常有前途的多功能试剂，可用于肝损伤的早期诊断和药物筛选，以及有效的肿瘤治疗和使用自我监测方法实时评估有效性。
参考文献
https://doi.org/10.1002/adhm.202402614
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