内容提要
胰腺癌被称为“癌症之王”，探索胰腺癌的有效诊断和治疗技术仍然是一项极具吸引力但又极具挑战性的任务。光疗由于其独特的优点，近年来受到了广泛的关注。然而，传统光治疗材料穿透深度有限、氧依赖性强、热休克蛋白抑制程度高，严重影响了其整体治疗效果，尤其是对胰腺肿瘤等深部缺氧肿瘤。本研究通过分子工程巧妙构建了具有聚集诱导发射(AIE)特征的光敏剂DCTBT，该光敏剂同步共享NIR-II荧光成像(FLI)、氧依赖性减弱的i型光动力治疗(PDT)和高效光热治疗(PTT)功能。在EGFR靶向肽修饰的两亲性聚合物的帮助下，制备的负载DCTBT的脂质体能够有效地在胰腺肿瘤中积累和显影，并显著抑制皮下和原位PANC-1肿瘤小鼠模型的肿瘤生长。
分子设计与光物理性质
采用电子给受体(D-A)法将强电子接受单元苯并[1,2-c:4,5-c ']双([1,2,5]噻二唑)(BBT)与供电子部分咔唑连接，构建了π共轭化合物CTBT和DCTBT。CTBT和DCTBT的合成路线和结构表征见补充资料。高D-A强度有利于有效的分子内电荷转移(ICT)，从而降低带隙，实现长波长吸收和发射。支链烷基噻吩单元被用作电子给体和π桥。噻吩上的邻位烷基链提供了一定的空间位阻，使分子具有扭曲构型，增强了溶解度。DCTBT的关键设计是在咔唑单元中引入了二苯胺片段，与CTBT相比，这显著改善了DCTBT的多项光物理性能。二苯胺片段的存在可以促进更强的分子内D-A相互作用，从而实现更小的带隙和红移的吸收和发射，促进i型ROS的生成。此外，二苯胺片段可以作为自由旋转的分子旋转体，消耗激发态能量，同时延长两个平行平面之间的分子间距离，显著减少分子间π-π相互作用，从本质上提高DCTBT的AIE表征。通过紫外-可见光谱和PL光谱对CTBT和DCTBT的光学性质进行了研究。它们在CHCl3中的吸收最大值分别在682 nm和704 nm处达到峰值，这与理论计算的能带隙一致。CTBT和DCTBT在CHCl3中的最大发射峰分别位于858 nm和995 nm。为了研究它们在聚集体状态下的荧光特性，记录了不同水分数的THF/H2O混合物的光致发光光谱。CTBT的发射强度随水分数从0到50%的增加而逐渐降低，这可归因于其分子内扭曲电荷转移(TICT)效应。随着含水率从50%进一步增加到90%，排放强度有所提高，但仍低于溶液状态。相反，水分数为90%的DCTBT混合物的PL强度比溶液状态增强了5.9倍，强烈地表现出其典型的AIE特征。
纳米颗粒的制备与表征
为了进一步在形态水平上解读CTBT和DCTBT的光物理性质，我们以生物相容性两亲共聚物DSPE-PEG2000为包封基质，通过纳米沉淀法将这两种AIEgens组装成纳米粒子(NPs)。动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)显示，制备的CTBT NPs和DCTBT NPs具有良好的水分散性和均匀的球形形貌，直径分别约为67 nm和100 nm。此外，CTBT NPs和DCTBT NPs在纯水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、PBS加10%胎牛血清(FBS)等不同培养基中的粒径变化，在环境条件下储存两周后，其变化可以忽略不计，表明这些NPs具有良好的胶体稳定性。此外，与单分子状态下的结果一致，与CTBT NPs相比，DCTBT NPs的吸收/发射红移达到了峰值。DCTBT NPs在1008 nm处表现出较强的近红外发射，并且大部分延伸到NIR- ii区域，这保证了DCTBT NPs对体内NIR- ii FLI的效率。由于两种NPs的吸收差异，分别采用660 nm和808 nm激光作为照射源，研究其抗光漂白性能。如图所示，CTBT NPs和DCTBT NPs在光稳定性方面明显优于市售且声誉良好的近红外染料吲哚菁绿(ICG)。在808 nm激光连续照射30分钟后，ICG水溶液几乎完全消除了近红外吸收。而在相同条件下，CTBT NPs和DCTBT NPs在水、PBS和10% FBS中的吸收曲线变化可以忽略不计。此外，以IR-26 (QY = 0.5%)为参考，CTBT NPs和DCTBT NPs水溶液在900-1500 nm发射范围内的量子产率(QYs)分别高达16.92%和4.37%。值得注意的是，这些NPs的NIR-II发射特性和高荧光效率使它们成为生物应用的理想候选者。在DCTBT NPs存在的情况下，经过6分钟808 nm激光(0.8 W cm-2)照射后，DCFH的荧光强度达到了初始强度的400倍以上，清楚地表明了良好的总体ROS生成效率。在660 nm激光照射下，CTBT NPs的荧光强度增强了111倍。DCTBT NPs比CTBT NPs具有更强的ROS生成能力，这可以归因于更有效的系统间交叉(ISC)过程，DCTBT分子的单三重态能隙(0.80 eV)比CTBT分子(0.97 eV)小得多。此外，DCTBT NPs的ROS生成效率与市面上常见的玫瑰孟加拉光敏剂(RB)相当。我们使用不同的ROS指标进一步详细区分了ROS的种类。利用二氢霍达明123 (DHR123)和羟基苯基荧光素(HPF)检测i型ROS的生成，这两种ROS不具有荧光性，但分别与•OH和O2•反应时能发出绿色荧光。如图所示，探针组和NPs单独组在近红外激光照射6 min后几乎没有观察到荧光信号。值得注意的是，在CTBT NPs或DCTBT NPs存在的情况下，DHR123和HPF探针的荧光强度随近红外激光照射明显增加，这表明CTBT和DCTBT NPs都可以通过i型路径有效产生•OH和O2•-。此外，DCTBT NPs的•OH和O2•-生成能力明显强于CTBT NPs, O2•-生成效率与RB相当，进一步体现了DCTBT NPs的O2•生成能力。此外，利用常见的单重态氧(1O2)指示剂9,10-蒽二基双(亚甲基)-二丙二酸(ABDA)检测ii型ROS (1O2)的生成，因为它的吸收强度可以被1O2分解。如图所示，RB在白光照射下可诱导ABDA逐渐分解。然而，在CTBT NPs和DCTBT NPs存在的情况下，近红外激光照射下ABDA的吸收强度没有明显变化，这表明AIE NPs通过ii型途径生成1O2受到抑制。据我们所知，同时具有nir激发和纯i型ROS生成的有机ps很少被报道。对CTBT NPs和DCTBT NPs的光热性能进行了评价。如图所示，在相同的激光(808 nm, 0.8 W cm-2)照射5分钟下，CTBT NPs和DCTBT NPs水分散体的最高温度分别达到55.7和62.8℃。根据热-冷循环，CTBT NPs和DCTBT NPs的光热转换效率分别为57.7%和59.6%。DCTBT NPs的光热转换性能优于CTBT NPs，其非辐射衰变过程比CTBT NPs更有效，这可能是由于DCTBT的二苯胺部分的存在导致其更扭曲的构象。DCTBT NPs表现出浓度依赖的温度升高。808 nm激光照射6 min后，温度从37℃升高到61℃，DCTBT NPs浓度从20 μg mL升高到300 μg mL-1。
靶向脂质体体外杀瘤研究
我们用DSPE-PEG2000-GE11修饰脂质体的表面，通过受体介导的内吞作用促进脂质体在细胞内的摄取，然后在靶向癌细胞中释放药物。本文将制备的含或不含DSPE-PEG2000-GE11的两种唇形dctbt NPs分别简称为Target-NPs和non-Target-NPs。低温透射电镜(cryo-TEM)显示，唇型dctbt NPs具有高水溶性，呈球形。对唇型dctbt NPs的尺寸分布分析表明，低温透射电镜的平均直径为80 nm, DLS的平均直径为121 nm。我们评估了两种lip-DCTBT NPs在PANC-1癌细胞中的细胞内ROS生成。采用DCFH-DA、DHE、APF和SOSG四种不同的细胞透性荧光探针分别监测总ROS、O2•、•OH和1O2的生成。将PANC-1癌细胞与这两种唇型dctbt NPs和各种荧光探针一起孵育，用PBS缓冲液洗涤，用808 nm激光(0.8 W cm-2)照射5分钟，最后用荧光显微镜记录荧光图像。如图所示，唇部dctbt NPs加808 nm激光照射后，DCFH-DA、DHE和APF三种探针均发出明亮的绿色或红色荧光，而对照组(不加唇部dctbt NPs组和不加激光照射组)几乎没有观察到明显的荧光信号，说明唇部dctbt NPs能在PANC-1癌细胞中高效生成O2•-和•OH。
PANC-1荷瘤小鼠模型的体内显像及治疗
首先实时进行NIR-I FLI，监测lip-DCTBT NPs的分布和肿瘤靶向能力。采用尾静脉注射唇型dctbt NPs的方法，对皮下有PANC-1肿瘤的BALB/c裸鼠进行腹腔注射。注射后1 h，唇型dctbt NPs在肿瘤部位出现荧光信号，且荧光强度随时间逐渐增强，提示唇型dctbt NPs通过增强渗透性和滞留性(EPR)效应在肿瘤部位有效积累。注射后24 h，对切除的主要器官和肿瘤组织进行体外FLI，进一步评估唇部dctbt NPs的生物分布。肿瘤组织的荧光信号强于主要器官的荧光信号，表明lip-DCTBT NPs在肿瘤部位的有效积累。考虑到出色的NIR-II发射特性，我们进一步利用lip-DCTBT NPs进行体内NIR-II FLI，以精确靶向和检测肿瘤。小鼠的NIR-II FLI比NIR-I FLI提供了更深的穿透和更高的肿瘤组织清晰度，这是由于在NIR-II窗口中抑制了光子散射和降低了组织自身荧光。此外，注射后48 h，肿瘤部位的荧光信号仍然很强，表明lip-DCTBT NPs具有长期NIR-II FLI示踪肿瘤的巨大潜力。值得注意的是，在NIR-I和NIR-II FLI中，target - nps治疗组与非target - nps治疗组相比，随着时间的推移，肿瘤部位的荧光成像更亮，这主要归因于引入EGFR配体导致的肿瘤靶向能力增强。为了验证dctbt NPs的光热治疗潜力，我们对皮下pac -1荷瘤小鼠进行了体内光热评价。静脉注射后lipDCTBT NPs 8 h,老鼠的温度实时监控,红外热成像系统,在肿瘤部位被波长808纳米的激光辐照(0.8 Wcm-2)照射5分钟。如图所示,Target-NPsadministrated老鼠的肿瘤区域的温度迅速增加从32.9到59.6◦C内只有1分钟,和到达了一个高原在5分钟内63◦C,揭示了PTT的应用潜力巨大。正如预期的那样，target - nps处理的小鼠比未target - nps处理的小鼠(△T = 27.7◦C)表现出更高的温度升高(△T = 30.4◦C)，主要归因于DCTBT在肿瘤组织中更有效的积累。
总结
我们首次成功开发了一种具有NIR-II FLI、i型PDT和PTT功能的aie活性光治疗剂。通过在CTBT骨架上合理引入二苯胺片段，得到的分子DCTBT具有更好的AIE性能，吸收和发射波长红移。与CTBT NPs相比，DCTBT NPs具有更强的电子D-A相互作用和更小的△EST，具有红移NIR-II发射，更有效的i型ROS生成和更高的光热转换效率。为了最大限度地提高光疗效果，我们进一步采用egfr靶向肽修饰的两亲性聚合物DSPE-PEG2000-GE11作为掺杂包封基质，促进唇部dctbt NPs在肿瘤部位的积累。体外和体内实验均表明，在NIR-II fli引导的i型PDT-PTT协同治疗中，Target-NPs对皮下和原位PANC-1肿瘤小鼠模型均具有显著的肿瘤生长抑制作用。
参考文献
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2022.121476
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