内容提要
我们报道了一种致盲探针HM-DS655-Halo，它在与HaloTag结合之前保持闪烁关闭状态，从而触发其自闪烁活性，并使其能够在活细胞中直接进行SMLM成像。我们采用自眨眼激活前后占空比的比值，称为参数“RDC”来表征眨眼性。与HaloTag的共价结合诱导HM-DS655-Halo从荧光OFF状态转变为荧光闪烁状态。这种转变也导致RDC值的变化，计算为12，确保了在活细胞中有效抑制背景信号的超致盲性。HM-DS655-Halo成功应用于各种细胞内亚结构的动态SMLM成像，背景噪声最小，包括线粒体裂变和接触，细胞迁移和假足生长。荧光探针在与靶结合时表现出显著的荧光增强，被广泛用于消除背景信号。其中，罗丹明基探针表现突出，因为它们存在于非荧光螺旋环和荧光两性离子之间的平衡中以产生荧光性这些探针还与常用的自标记标签HaloTag具有良好的相容性，HaloTag可促进螺环罗丹明偶联形成荧光两性离子，从而具有良好的荧光增强效果。因此，这对基于罗丹明的探针和HaloTag为超分辨率成像提供了一个有吸引力的选择。在本文中，我们提出了探针HM-DS655-Halo响应自发闪烁探针高荧光性的需求。该探针在与目标结合之前保持不闪烁，从而触发强大的自发闪烁活动。HMDS655-Halo源于我们之前报道的在中性pH条件下的自闪烁染料HM-DS655，具有显著的优势。虽然HM-DS655的自闪烁依赖于ph值，并且可能导致非目标相互作用产生不希望的闪烁信号，但HM-DS655- halo表现出独特的“致闪烁”特性，仅在目标识别时产生荧光闪烁。具有这些特征的探针，只显示荧光闪烁以响应目标结合，被归类为“致盲探针”。在这里，我们使用自眨眼激活前后的占空比，称为参数“RDC”来表征眨眼性。占空比表示荧光团保持在“开”状态与“关”状态的时间之比。显示高占空比的探针在荧光“开”状态下花费相当多的时间。相反，具有“低占空比”的探针在非荧光或弱荧光暗状态下花费更多时间。当RDC值超过1时，表示探针在分子识别时发生自闪激活。识别前的低占空比，加上较高的RDC值，将增强信噪比和闪烁特性，从而有利于SMLM成像。HM-DS655-Halo的pKcycl降至4.5以下，有效地稳定了生理条件下（pH 7.4）的闪烁，并保留了探针内罗丹明螺旋环的结构。而与HaloTag结合后，探针的两性离子结构会在HaloTag的微环境中得到稳定，导致持续的自发闪烁。RDC值达到12，表明对HaloTag蛋白的识别选择性地触发探针的自闪烁，在SMLM成像中具有出色的消除背景干扰的能力。最后，使用HM-DS655-Halo，我们成功地实现了细胞内动力学的SMLM成像，包括线粒体裂变和接触，细胞迁移和假足生长。
首先测量HM-DS655-Halo在不同溶剂（0.1% TFA）中的光谱特性。HM-DS655Halo在H2O中有654nm的吸收峰，最大荧光强度为670nm。值得注意的是，该探针显示出0.45的量子产率，确保了每个闪烁事件有足够的光子数量和更高的定位精度。随后，检测HM-DS655-Halo对不同pH值的荧光响应，并记录668 nm处的荧光强度。HMDS655-Halo的pKcycl小于4.5，低于生理条件下自我眨眼所需的标准pKcycl范围5.2-6.0。pH = 7.4时ON分子的百分比小于0.0008，说明HMDS655-Halo在与Halo Tag结合前呈现自发闪烁的off状态。这强调了HM-DS655-Halo在SMLM成像中抑制背景信号的能力。为了评估致盲性，接下来研究HM-DS655-Halo对纯化的HaloTag蛋白的反应。在加入HaloTag后，HM-DS655-Halo表现出明显的荧光发射，并显著增强7.2倍，这表明HaloTag确实稳定了HM-DS655-Halo的两性离子形态，促进了ON态的形成。阴离子表面活性剂SDS的ON态活化进一步证实了这一点，这也引发了荧光发射。在HaloTag存在和不存在的情况下，检测了HMDS655-Halo的单分子荧光特性。HM-DS655-Halo在没有HaloTag的情况下表现出可以忽略不计的ON/OFF开关，而与HaloTag结合后，它变得活化，显示出多个荧光ON/OFF开关周期。RDC为12，表现出良好的致盲性和背景抑制。此外，增加的周期数和延长的ON-time有助于更快的成像，增强定位精度和提高分辨率。这种由halotag激活的自发眨眼进一步提高了定位精度和每个事件的光子数。而报道的HaloTag自发闪烁探针HMSiR-Halo显示出明显较低的RDC（~1.06）和开关数，表明在分子识别时缺乏自闪烁激活。我们还合成了用于SNAP-tag的探针HM-DS655-SNAP，但其与SNAP-tag共价连接后不表现荧光增强或自眨眼行为。基于罗丹明的荧光探针的分子机制包括它们与HaloTag和SNAPtag蛋白结合，通过与附近带负电荷的蛋白位点的静电相互作用触发罗丹明开环。然而，HM-DS655-SNAP与SNAPtag相互作用后，并没有出现罗丹明开环现象，这可能是由于与SNAP相邻部分的静电相互作用较弱。修改探针结构可以开发用于SNAP-tag的致盲探针。这种蛋白质环境依赖性确保了致盲探针的选择性。在这里，HM-DS655-Halo作为HaloTag特异性致盲探针。针对不同蛋白质的各种致盲探针的创建将促进多色SMLM成像。
我们检测了HM-DS655-Halo在活细胞中的致盲性。在未转染HaloTag蛋白的HeLa细胞中加入HMSiR、HMSiR- halo和HM-DS655-Halo等不同探针，通过检测细胞中是否存在荧光信号来确定探针的非靶干扰信号。HM-DS655-Halo处理的细胞背景信号可以忽略不计，而HMSiR和HMSiR- halo处理的细胞由于其pKcycl为5.8而表现出明显的荧光。这突出了HM-DS655-Halo抑制背景信号的能力。然后，分别瞬时转染了LifeactHaloTag（用于肌动蛋白）、TOMM20-HaloTag（用于线粒体外膜）和H2B-HaloTag（用于细胞核）的Hela细胞，用HM-DS655-Halo孵育，评估其对不同细胞亚结构的SMLM成像性能。从10,000帧重建的肌动蛋白的SMLM图像显示出清晰的微丝，定位精度高达17.4 nm，每事件853个光子。SMLM成像显示丝状足的宽度为120.4 nm，而WF成像显示丝状足的宽度为420.8 nm。此外，SMLM成像可以区分两个相邻的微丝，在WF中显示为一个微丝。高度动态的线粒体外膜也用TOMM20上标记的HM-DS655-Halo进行了解析，平均检测到649个光子，定位精度为23.3 nm。发现线粒体双层外膜之间的距离为170 nm。此外，细胞核的SMLM图像可以识别单个H2B蛋白，定位精度为18.9 nm。超分辨率图像中的空白区域勾勒出核仁的轮廓，说明HM-DS655-Halo具有特异性和低闪烁背景。用不同浓度的HM-DS655-Halo对活的HeLa细胞进行SMLM成像，显示清晰的细胞核图像。这些结果证明了HM-DS655Halo在抑制闪烁背景的情况下，适用于活细胞的SMLM成像。我们的探针在亚细胞器分辨率下的蛋白质成像中的优异表现促使我们研究其在长期SMLM成像中的能力。
线粒体被称为细胞的能量工厂，通过线粒体接触、裂变、融合等多种动态行为来实现多种功能这些动态行为是不可预测的，不仅需要单分子水平的空间分辨率，还需要高时间分辨率和较长的成像时间，这是目前SMLM成像面临的挑战得益于出色的高占空比自发闪烁性能，HMDS655-Halo可以在100秒内以10秒的时间分辨率跟踪线粒体动力学，捕获各种裂变（ROI 1）和接触（ROI 2）事件。如图所示，虚线框内成功观察到线粒体分裂。相邻的线粒体在裂变前由延伸的管状中间体（用蓝色箭头标记）连接，在20-80秒内分离形成单个的小线粒体。此外，还监测了两个分离线粒体之间的瞬时接触。图中用蓝色箭头标记的线粒体，每一个都延伸出触手状的分支，并在30秒时向中心移动。然后在白色虚线框内触发亲密接触并持续40-80秒。两个线粒体在90秒分离，恢复到初始状态。图中相邻线粒体的强度分布图进一步说明了线粒体接触的整个过程，包括分离、接触和再分离，在接触部位荧光强度先升高后降低。这些结果证明了HM-DS655Halo在线粒体动力学的长期SMLM成像中的能力，突出了其优异的致盲性、特异性和稳定性。
总结
我们报道了一种致盲探针HM-DS655Halo，该探针在与HaloTag结合之前显示荧光关闭，从而激活其自闪烁以进行SMLM成像，而无需洗除步骤。用自眨眼激活前后占空比RDC的比值来表征对荧光背景的致盲性。探针与HaloTag结合后，计算出RDC值为12，表现出出色的目标特异性自闪烁。这有效地消除了在单分子定位成像中由未反应或非特异性结合探针引起的背景干扰。最后，我们揭示了HM-DS655-Halo在低背景下多种细胞内亚结构动态SMLM成像中的应用。在高时空分辨率下监测线粒体裂变和接触、细胞迁移和假足生长，突出了我们的探针在SMLM成像中的潜在应用。随着空间分辨率接近1nm和亚纳米尺度，单分子定位成像将越来越多地需要致盲探针来减少噪声信号干扰，特别是需要更多种类的不同颜色的探针。HM-DS655-Halo通过改变罗丹明螺旋的开关平衡的结构调制实现致盲性。鉴于我们之前开发的定量理论描述子ΔGC-O可以定量描述罗丹明螺旋平衡与分子结构之间的关系，我们预计HM-DS655-Halo和ΔGC-O的组合将激发这种多色致盲探针的创建。
参考文献
https://doi.org/10.1002/anie.202417469
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