内容提要
开发具有强大的吸收能力、优异的第二近红外(NIR-II)荧光和突出的光热转换能力的单分子物种是光疗学非常需要的，但仍然具有巨大的挑战性。在这项工作中，我们提出了一种分子设计理念，即非共价构象锁(NoCLs)与聚集诱导发射(AIE)在单一配方中的整合能够提高多种光物理特性，从而实现高效的光疗。在分子结构中心引入具有构象锁定特征的NoCLs骨架，确实提高了结构的平面度和刚性，同时提高了吸收能力，使以NIR-II区为中心的发射波长发生了色移。同时，AIE倾向主要源于分子结构末端灵活的螺旋桨状几何结构，最终使分子具有令人满意的发射强度和聚集体的光热转换。
分子设计、合成及其光物理性质研究
采用具有强烈电子D-A相互作用的发色团结构非常有利于极大地促进分子内电荷转移，从而导致更低的电子带隙以及更长的吸收/发射波长。在此原理的指导下，我们设计并合成了两个具有典型D-A-D结构的发色团TITQ和TEEITQ，如图所示。其中，具有较大π共轭片段和强吸电子能力的吲哚酮-缩合噻二唑[3,4g]喹诺啉(ITQ)作为A单元。利用其独特的特性，选择双(3,4-乙烯二氧噻吩)作为强D和nocl骨架，以保证提高吸收/发射和扩大吸收能力。此外，扭曲的四苯基乙烯(TPE)片段被用作较弱的供体和活性分子转子，预计可以延长分子间距离，从而提高荧光效率。此外，引入接枝在TPE基团上的烷基链作为studdle units来调节分子结构，即使在聚集状态下也能诱导相对松散的分子间堆积，这有利于保留部分分子内运动，促进光激发时的产热。采用紫外-可见-近红外光谱(UV-vis-NIR)和光致发光光谱(PL)研究了这两种分子的光学性质。如图所示，TITQ在587 nm处的吸收峰最大，摩尔消光系数(ε)为0.86 × 104 M-1 cm-1，而TEEITQ在799 nm处的吸收峰扩展，ε大幅增强，达到1.68 × 104 M-1 cm-1(几乎是TTIQ的两倍)，相当接近808 nm，这是一种广泛使用的激发激光源。这种吸收和ε的明显增加验证了在TEEITQ骨架中插入多个nocl (S··O和S··N)加强分子内D-A相互作用的积极作用，极大地增强了分子刚度，从而提高了吸收强度和波长。随后，TEEITQ的荧光发射表现出明显的色移，这可以归因于双(3,4-乙烯二氧噻吩)电子效应的引入。值得注意的是，TEEITQ表现出更大的宽度，并且部分发射光谱落在NIR-II区域(超过1000 nm)，而TITQ只有一个延伸到1000 nm的尾部。由于活跃的分子内运动对激发态的快速能量消耗，这两种化合物在纯THF溶液中都表现出微弱的荧光发射。随着水分数的增加，它们的荧光发射强度逐渐提高，这是由于分子内运动受到明显限制，具有典型的AIE特征。此外，还研究了TITQ和TEEITQ在溶液态和纳米粒子态的相对量子产率(QYs)。由图可知，纯THF溶液中TITQ和TEEITQ的qy分别为~0.02%和0.24%。同时，水溶液中TITQ NPs和TEEITQ NPs的qy分别增加到0.28%和0.26%，进一步明确具有典型的AIE特征。更具体地说，在NIR-IIa区域( 1000~1500 nm)， TEEITQ NPs的QY(~0.21%)比TITQ NPs(~0.09%)高2倍。
再加上TEEITQ NPs优越的光收集能力， TEEITQ NPs在NIR-IIa窗口中比TITQ NPs具有更高的荧光亮度(通常定义为摩尔消光系数(ε) × QY)，进一步证明了本文提出的“AIE + NoCLs”策略在操纵物理性质方面的有效性，也极大地有利于后续NIR-II荧光成像的体内研究。为了进一步研究这两种化合物的聚集态性质，采用纳米沉淀法，以两亲性聚合物DSPE-mPEG2000为掺杂基质，将这两种化合物分别包封成可溶于水的纳米颗粒(NPs)。通过动态光散射(DLS)测量，制备的纳米颗粒的水动力直径分别为122 nm和147.5 nm，通过增强的渗透性和滞留性(EPR)效应，纳米颗粒的水动力直径最适合被动积累目标。透射电子显微镜(TEM)图像显示，TITQ和TEEITQ NPs的直径范围为100~120 nm，比DLS显示的直径范围小。如图所示，确定TEEITQ NPs的zeta电位为-12.5 mV。值得注意的是，在环境条件下储存两周后，NPs的大小变化可。这些结果表明TEEITQ NPs具有良好的胶体稳定性。此外，在808 nm激光连续照射20 min后，TEEITQ NPs表现出优异的抗光漂白稳定性，而临床上常用的吲哚菁绿(ICG)则表现出严重的光漂白，这进一步证明了TEEITQ NPs具有良好的光稳定性，可用于肿瘤的长期成像和有效光疗。
体外光疗效果
由于TEEITQ NPs在多种癌症光疗方面的巨大前景，我们随后探索了TEEITQ和GA联合对小鼠乳腺癌4T1细胞的体外光疗效果。首先采用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察TEEITQ NPs在4T1肿瘤细胞中的胞内行为。为了便于CLSM可视化，采用纳米沉淀法将DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000FITC与疏水性TEEITQ共组装，制备了荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的TEEITQ NPs。一般采用PEG衍生物作为包埋基质对光治疗剂表面进行修饰，可避免巨噬细胞吞噬，大大增强循环稳定性，延长循环时间，也有利于改善EPR效应驱动的光治疗剂在实体瘤中的蓄积。如图所示，在4T1细胞内观察到FITC荧光团发出的亮绿色荧光，与商业溶酶体Tracker red发出的红色荧光具有良好的共定位，Pearson相关系数为~0.58，说明TEEITQ NPs被大量内化到4T1细胞的溶酶体中。在指定的时间间隔给药TEEITQ NPs后，通过荧光活化细胞分选(FACS)分析进一步研究TEEITQ NPs在4T1细胞中的细胞内化效率。fitlabeled TEEITQ NPs的荧光强度有随时间增加的趋势，在孵育6 h后达到最大，显示出高效的细胞内化，为后续对4T1细胞的光热效应奠定了坚实的基础。在此基础上，通过细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)检测，进一步评估近红外激光诱导的TEEITQ和GA NPs联合对4T1细胞的杀伤作用。混合TEEITQ和GA NPs对4T1癌细胞表现出轻微的暗细胞毒性，因为GA本身具有抗癌药物的作用。
体内成像和抗肿瘤性能
TEEITQ NPs明亮的NIR-II荧光特性和优异的肿瘤杀伤效率促使我们进一步研究其体内治疗性能。在初步研究中，评估了混合TEEITQ和GA NPs的生物相容性。如图所示，TEEITQ + GA NPs给药24小时后，小鼠苏木精和伊红(H&E)染色切片未见明显的主要器官损伤或炎症病变，这为TEEITQ + GA NPs具有高生物相容性提供了有力的证据。然后，通过静脉注射这些NPs到4T1荷瘤小鼠体内，观察其体内多模态成像诊断和化学光热治疗性能。在NPs给药前，FLI和PAI都没有表现出明显的信号，这是由于900 nm长通(LP)滤光片对自身荧光的干扰很小。在FLI病例中，注射后4 h，在肿瘤部位捕获到强烈的NIR-II荧光信号，提示肿瘤区域TEEITQ NPs逐渐富集。在接下来的近20 h内，NIRII荧光信号随着时间的延长而急剧增强，并在注射后24 h达到平稳期。此外，由于代谢作用，肿瘤部位的光信号在24 h内逐渐下降。采用功率密度为0.8 W cm-2的808 nm激光作为照射源，照射10 min，评估TEEITQ + GA NPs的体内多成像引导光疗效率。利用红外热像仪采集相应的光热图像(PTI)，监测小鼠体内温度变化。温度随曝光时间的变化曲线显示，由于TEEITQ NPs优越的光热特性，肿瘤部位温度仅在2 min内就从36.6℃升高到49.5℃。将时间延长至10min，平台温度达到52.2℃，由于组织阈值温度为42℃，可能导致不可逆的细胞损伤，相反，在相同的照射条件下，注射PBS的小鼠的温度变化可以忽略不计。特别值得注意的是，在照射过程中肿瘤部位的温度明显高于正常组织，进一步肯定了TEEITQ + GA NP由于其高空间可控性而具有肿瘤选择性传递和随后的照射部位特异性光疗作用，可以在很大程度上避免对邻近健康器官/组织的不良热致损伤。在证明具有三峰成像能力后，通过全身给药评估TEEITQ + GA NPs在4T1荷瘤BALB/c小鼠体内的杀瘤性能。实验中，所有小鼠只接受单次注射和一次808 nm激光照射。令我们高兴的是，TEEITQ + GA NPs +激光照射组几乎所有小鼠的实体瘤都被消融了，几乎没有任何可见的肿瘤残留，这归功于TEEITQ + GA NPs的精确积累和优越的化学光热联合治疗。同时，这些对照组的肿瘤在治疗期间迅速增大，肿瘤大小比仅使用TEEITQ NPs的小鼠大5倍。治疗期结束时，处死小鼠，取相应肿瘤称重。结果清楚地证实了TEEITQ + GA NPs的显著化学光热协同治疗。随后，通过组织学和免疫组织化学分析进一步探索其体内抗肿瘤机制。肿瘤组织切片H&E染色显示，单一抗癌药物GA NPs、TEEITQ NPs以及TEEIQT + GA NPs联合激光照射均可引起肿瘤组织严重破坏，肿瘤细胞异常明显，空洞多，核固缩明显。PBS处理组肿瘤细胞的膜和细胞核形态显示正常，可见肿瘤细胞过剩且排列密集。末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)免疫荧光染色结果证实细胞严重凋亡，与H&E染色分析结果吻合较好。
总结
总之，我们提出了一种创新的策略，通过巧妙地将nocl和AIE理念整合到单一配方中来放大荧光和光热性能。选择富电子的双(3,4-乙烯二氧噻吩)单元作为强给体和多NoCLs骨架，不仅能显著增强分子内D-A相互作用，延长吸收/发射波长，还能有效调节分子构象，增强光捕获能力。此外，由于AIE的特性，在聚集体中完成了荧光和光热转换，构建的分子TEEITQ被证明具有非凡的光疗输出。由于TEEITQ NPs具有良好的生物相容性和光物理性能，在808 nm激光照射下，TEEITQ NPs可以有效内化到4T1癌细胞中，并表现出优异的细胞杀伤能力。同时，体内实验结果表明，TEEITQ NPs能够在肿瘤部位积聚，并被NIR-II FLI-PAIPTI清晰点亮，只需一次静脉注射和一次照射即可完全消融肿瘤。总的来说，提出的策略为高效的NIR-II光疗剂提供了一个新的分子设计视角。
参考文献
https://doi.org/10.1002/anie.202413219
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