内容提要
在深近红外（deep NIR）光谱区域（即800 nm及以上）吸收/发射的荧光团由于具有更深的组织穿透性，在体内生物成像、诊断和光疗方面具有很大的前景。本文通过两步级联制备了深近红外吸收染料库（EA5）。它们在磷酸盐缓冲液中既不稳定也不明亮，因为它们是螺旋桨式的柔性支架。通过筛选，发现EA5_c3对牛血清白蛋白（BSA）具有较高的亲和力。结合相关的结构硬化导致26倍的荧光增强。白蛋白伴侣蛋白还通过屏蔽双苯环三芳基甲烷核心免受亲核或氧化物质的影响，极大地提高了EA5_c3的稳定性。所得EA5_c3@BSA具有较高的生物相容性。它提供高分辨率的血管系统、淋巴系统、肿瘤和其他组织成像，其明亮的深近红外发射。同时，它在乳腺皮下和原位肿瘤的光声成像和光热治疗中显示出突出的潜力。
分子设计合成与光物理性质研究
N，N-二甲氨基为1，N，N-二乙基氨基为2，三甲基化四氢喹啉为3，四甲基julolidine为4，用于调制光谱波长和亮度。筛选了四个不同的中心大体积芳香基团（a,b,c,d），即a代表邻甲基苯基，b代表1-萘基，c代表2,6-二甲基苯基，d代表9-蒽基，以调节化学稳定性。头基和中心芳香部分的系统结合最终设计和合成了15个EA5类似物库（EA5_a1-a4, b1-b4， c1-c4和d1-d3）。EA5_a1-a4在CH2Cl2中的紫外-可见吸收和发射光谱如图所示。n -烷基化图的变化对它们的光谱波长、摩尔吸收率和荧光量子产率有显著影响。EA5_a1在821 nm处有一个最大的吸收带，在747 nm处有一个较低强度的振动肩。在564 nm和513 nm处存在两个额外的峰，这可能是由于S0→S2吸收引起的。在820 nm光激发下，EA5_a1在927 nm处产生最大发射峰，并在1054 nm处出现一个肩尾峰。测试EA5系列在CH3CN和H2O （V:V = 1:1）混合物中的光物理性质。这反映了中心甲基碳的高亲电性和来自2-甲基苯基或1-萘基的空间保护不足。相比之下，EA5_c1-c4和EA5_d1-d3在几十分钟内没有明显的吸光度下降，因此被选中进行进一步的研究。三芳基甲烷染料在硬化时表现出增强的荧光。随着介质粘度的增加，EA5染料的荧光也增加了十倍。较高的温度破坏了溶剂分子之间的氢键网络，降低了介质粘度。因此，我们预计EA5_c3的荧光会随着温度的升高而降低。实验结果证实了这一点。进一步测试了EA5染料与牛血清白蛋白的结合。获得了EA5 （10 μm）与BSA （100 μm）在PBS （10.0 mm, pH 7.4）中的吸收和发射光谱。EA5_c1-c4的吸收光谱与PBS缓冲液中的吸收光谱有显著差异。加入BSA后，吸收带变得更锐利，更像CH2Cl2中的吸收带，表明形成了染料- sa配合物。它们的发射光谱表明，与SA结合后荧光显著增强，如EA5_c1的荧光增强13倍，EA5_c2的荧光增强24倍，EA5_c3的荧光增强26倍，EA5_c4的荧光增强30倍。然在EA5染料溶液中加入牛血清白蛋白后，荧光明显开启，表明这些染料是牛血清白蛋白的良好配体。
EA5_c3@BSA的体外光热和光声研究
在磷酸盐缓冲盐水（PBS）缓冲液（10.0 mm, pH 7.4）中评估EA5_c3@BSA的体外光热性能。记录了浓度和激光功率相关的温度升高（∆T）相对于880 nm激光照射时间。EA5_c3@BSA表现出优异的热循环稳定性，前四个循环如图所示。利用热平衡方程计算了EA5_c3@BSA在PBS缓冲液中的光热转换效率（PCE），达到了60.86%。相比之下，游离EA5_c3在DMSO中的PCE为68.80%。这表明BSA包封减少了激发态能量损失，导致PCE降低。高效光热剂通常也是良好的光声（PA）剂，在光声成像和光热治疗方面具有潜力。因此，在PBS缓冲液（10.0 mm, pH 7.4）中测试不同浓度EA5_c3@BSA的PA强度。选取915 nm激光器作为激发源。检测到强烈的PA信号，PA强度与EA5_c3@BSA浓度呈线性关系，表明EA5_c3@BSA具有近红外光声成像的潜力。
体内近红外荧光成像
将PBS溶液EA5_c3@BSA （2.0 mg kg−1，以EA5_c3计）静脉给予麻醉的BALB/c小鼠。用915 nm激光激发进行体内成像。首先，为了优化成像设置，分别在1000 nm、1100 nm、1200 nm、1300 nm、1400 nm和1500 nm处使用不同截止波长的长通滤光片对左后腿血管进行成像。较长的波长截止要求较长的曝光周期。随着截止波长的增加，血管的信本比明显提高，可以高对比度地显示复杂的血管网络，包括股动脉、股静脉，甚至直径只有几微米的更小的血管。在1400 nm的长通滤光片和500 ms的曝光时间下，获得了最高的SBR为2.98。经高斯函数拟合，确定股动脉和股静脉直径分别为54 μm和115 μm。使用不同的长通滤光片从腹侧和背侧对全身血管网络进行成像腹部血管和细毛细血管如图所示。根据黄线所标记的ROI，获得的优秀sbr在1.53 ~ 3.30之间。我们还比较了EA5_c3@BSA和fda批准的ICG@BSA在小鼠腹部和腿部血管成像方面的效果。由于EA5_c3@BSA的波长比ICG@BSA的波长长，所以当波长超过1200 nm时，使用EA5_c3@BSA获得的图像质量更高在去除小鼠头皮、颅骨完整的情况下，可以直接成像复杂的脑血管。荧光谱显示SBR为1.99。然后，处死小鼠，切开胃皮肤和肌肉层，露出肠道。肠系膜和肠的毛细血管网络成像。肿瘤细胞通过淋巴系统的迁移会导致淋巴结肿胀，因此淋巴结和淋巴管的成像很重要。将EA5_c3@BSA （2.0 mg kg−1，以EA5_c3计）分别注射到股肌和脚底，对腹股沟、坐骨、腰椎和肱淋巴结及其连接的淋巴管进行成像。微米级淋巴管的精细结构也被观察到。为了进一步说明EA5_c3@BSA在指导手术中的潜力，我们进一步进行了淋巴结手术切除的概念验证。
小鼠皮下4T1肿瘤的光热治疗
在光热治疗之前，我们研究了EA5_c3@BSA在4T1细胞中的细胞内分布。4T1细胞用EA5_c3@BSA （20 μm）染色5 min，然后用PBS缓冲液（10 mm, pH 7.4）洗涤3次。以880 nm的激光束作为激发光，收集900 nm以上的荧光。正如我们所料，EA5_c3@BSA在4T1细胞中发出明亮的荧光。与高毒性MG分布在细胞核中并引起明显毒性不同，EA5_c3@BSA主要分布在细胞质中，具有较高的生物相容性。研究EA5_c3@BSA在880 nm激光照射下产生的热量是否能杀死肿瘤细胞。进一步进行活细胞/死细胞染色。体外光热实验结果表明，功率密度为1.0 W cm−2、波长为880 nm的激光可以轻微地提高温度，因此选择该激光作为激发光源。4T1细胞用钙黄素AM和碘化丙啶（PI）共染色，共聚焦图像显示不同组的活细胞（绿色通道）和死细胞（红色通道）。在880 nm激光（1.0 W cm−2）照射下，EA5_c3@BSA （20 μm）染色的细胞死亡，显示光热治疗效果。CCK-8法检测EA5_c3和EA5_c3@BSA对4T1乳腺肿瘤细胞的暗毒性和光毒性。CCK-8实验表明，EA5_c3和EA5_c3@BSA均具有良好的生物相容性，在50 μm条件下孵育24 h后，细胞存活率均保持在80%以上，而880 nm激光处理组在相同浓度下，细胞存活率低至20%，显示出高毒性。随后，我们使用Annexin V-FITC/PI染料研究了EA5_c3@BSA诱导的高温下细胞死亡途径。不同处理的4T1细胞流式细胞术分析显示，与其他组（PBS为7.6%，PBS+Laser为7.8%，EA5_c3@BSA为11.6%）相比，“EA5_c3@BSA+Laser”组的凋亡或坏死百分比（41.2%）明显更高。这些结果与CCK-8光毒性结果高度一致，突出了EA5_c3@BSA通过光热效应杀死肿瘤细胞的有效能力。采用小鼠皮下4T1荷瘤模型，检测EA5_c3@BSA的体内光热治疗能力。将EA5_c3@BSA （2 mg kg−1，以EA5_c3计）静脉注射到异种移植4T1荷瘤BALB/c小鼠体内后，NIRII荧光信号在3 h出现在肿瘤区域，在12 h达到峰值。注射后12 h，对荷瘤小鼠实施安乐死，对肿瘤及主要脏器进行影像学检查。在肿瘤中观察到明显的NIR-II荧光信号，其次是肝脏荧光信号，主要归因于EA5_c3@BSA通过肝脏代谢。
总结
我们报道了简单的EA5制备方法，合成了稳定性高、与白蛋白结合后荧光强度增强20倍以上的EA5染料。与白蛋白相比，EA5_c3具有7.16 × 104 M−1 cm−1的高摩尔吸收系数、3.11%的理想荧光量子产率、2226.36 cm−1 M−1的高荧光亮度、5.01 × 105 M−1的高结合常数、1149 M−1 s−1的二级速率常数以及超过900 nm的吸收和发射波长，在EA5染料中脱颖而出。借助EA5_c3@BSA，血管造影和淋巴系统血管造影已经实现。同时，60.86%的高PCE也保证了肿瘤的高质量PA成像和高生物相容性小鼠肿瘤的光热治疗。总之，EA5_c3适用于肿瘤的FL/PA双峰成像和PTT。
参考文献
https://doi.org/10.1002/adma.202411515
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