内容提要
具有第二近红外窗口吸收功能的染料在光热治疗中具有广阔的应用前景。本文首次制备了新型的NIR-II 3,5-julolidinyl aza-BODIPY (JLD)，并通过x射线晶体学分析进行了证实。分子填充结构有利于Jaggregation填充模式。自组装的jld纳米粒子(JLDNPs)发出荧光(λem = 962 nm， Φf = 0.1%)，峰带覆盖NIR-II范围为900 ~ 1300 nm。光热转换效率高，经计算可达79%。NIR-II型915 nm激光照射JLDNPs具有良好的肿瘤抑制能力，可促进脑立体定向注射胶质母细胞瘤细胞的凋亡，抑制胶质母细胞瘤细胞的干性，影响肿瘤迁移、侵袭等恶性事件的发生。
以含julolidine酮为原料，基于经典的O’shea法合成了3,5-julolidinyl aza-BODIPY (JLD)。我们研究了JLD在不同溶剂中的光谱性质。CH2Cl2中的JLD吸收在880 nm，发射在968 nm，而DMSO中的JLD在NIR-II区吸收在906 nm，发射在1023 nm，由于溶剂效应表现出明显的色移。
利用2 '，7 ' -二氯二氢荧光素(DCFH)研究JLD/JLD- nps的ROS生成能力。根据DCFH的荧光变化，发现在相同条件下JLD- nps的ROS生成能力较低，略高于JLD。为了进一步确定活性氧的类型，以1,3二苯基异苯并呋喃(DPBF)作为单线态氧指示剂的吸光度衰减为基础，研究了JLD产生单线态氧(1O2)的效率。以亚甲基蓝(MB)为参考(DCM中ΦΔ = 0.57)，计算出JLD生成的单重态氧为0.02。为了提高JLD在生物体系中的生物相容性和水溶性，我们将DSPE-PEG2000和JLD自组装成JLD纳米颗粒(JLD- nps)。JLD-NPs的动态光散射(DLS)显示出合适的水动力直径(30 ~ 110 nm)，平均水动力直径和多分散性指数(PDI)分别为~ 8.82 nm和~ 0.213。此外，利用透射电子显微镜(TEM)对纳米颗粒的形态进行了测量。发现JLD-NPs在水中分散后足够稳定，可以聚集成近球形。由于聚集体效应， JLD- nps在水溶液中的吸收最大值(λabs = 908 nm)比JLD在水溶液中的吸收最大值(λabs = 856nm)发生了52 nm的色移，相应的吸收带覆盖了近红外区(700 ~ 1000 nm)，并且变得更宽。虽然JLD-NPs发出微弱的荧光(λem = 962 nm， Φf = 0.1%)，但其峰值波段覆盖了NIR-II范围900 ~ 1300 nm。我们研究了JLD-NPs的光热转换效率(PCE)。在915 nm激光照射(0.8 W cm−2,5 min)下，JLD-NPs (20 ~ 80 μM)水溶液中的温度逐渐升高，且升温效应与JLD-NPs的浓度成正比。在80 μM JLD-NPs和0.8 W cm−2光辐射5 min下，温度从20℃迅速升高到80℃。
为了探究JLD-NPs在生物学中的光热效应，我们检测了不同浓度(5 ~ 50 μM) JLD-NPs下GSCs的细胞活力。CCK8结果表明，不同浓度的JLD NPs对细胞在黑暗中的生存能力没有显著影响。在915 nm激光照射下，0 ~ 10 μM的JLD-NPs对GSC细胞活力无显著影响，而20 μM以上的JLD-NPs浓度可显著降低GSC细胞活力。凋亡是一种程序性细胞死亡，常用于评价光热染料对肿瘤细胞的杀伤能力我们选取常见的凋亡指标BCL2、BAX和Cleaved-Caspase3进行Western blot，评估不同浓度JLD-NPs在915 nm激光照射下对GSCs的影响。结果显示，JLD-NPs显著促进20 μM的GSCs凋亡，这与CCK8的结果一致。因此，后续实验选用20 μM作为JLD-NPs的建模浓度。在细胞凋亡的早期阶段，磷脂酰丝氨酸(PS)会从脂质膜的内部翻转到外部，使自己暴露在细胞的外部膜联蛋白V对PS具有高亲和力，可特异性结合PS暴露的细胞，可作为检测早期凋亡的指标之一。7-AAD是一种核酸染料，可标记晚期凋亡细胞和坏死细胞四组细胞经Annexin V和7-AAD双染后，流式细胞术结果显示，Light+NPs组处于凋亡状态的细胞比例(50.1%)明显高于其他三组(8%)，而JLD-NPs或915 nm NIR光的简单干预对GSCs的凋亡水平无显著影响。大量ROS的释放是JLD-NPs发挥其光动力效应的主要表现由于非荧光DCFH可被细胞内ROS氧化生成具有绿色荧光的DCF，因此产生的荧光信号强度与细胞内ROS水平成正比。
肿瘤干细胞具有很强的分化和自我更新能力，常被用作肿瘤的起源细胞和肿瘤恶性侵袭的来源Nestin、SOX2和CD133是肿瘤干细胞的常见标记物Western blot检测四组细胞干性标志物的表达水平。结果显示，Light +NPs组细胞干性标志物的表达水平明显低于其他三组，说明915 nm激光照射下JLD-NPs可以降低肿瘤干细胞的恶性程度。极限稀释分析和肿瘤球形成试验是评价细胞体外克隆形成能力的常用方法。Light+NPs组肿瘤球数明显低于其他三组。肿瘤成球实验显示，Light+NPs组的肿瘤球体积也比对照组小。这说明在915 nm激光照射和JLD-NPs处理下，GSCs的自我更新能力明显减弱，向恶性肿瘤的转化受到抑制。此外，我们还进行了transwell细胞侵袭实验来评估肿瘤干细胞的侵袭性Light+NPs组上腔细胞数量明显少于其他三组，说明Light+NPs组GSCs的侵袭减少，这与抑制肿瘤干性有关。
在体外细胞实验结果的基础上，我们进一步探讨了脑立体定向注射GSCs对JLD-NPs在小鼠体内实验中的有效性。立体定向注射药物可以绕过血脑屏障，使药物分子更容易到达脑深部。为了深入了解JLD-NPs的体内光热效应，用红外热像仪监测肿瘤部位的温度。激光照射后JLD-NPs组的温度高于PBS组，说明JLD-NPs具有光热效应。为评价JLD-NPs对肿瘤生长的抑制作用，对四组小鼠颅内肿瘤进行H&E染色，直观反映肿瘤大小。组织切除后测量颅内肿瘤的体积。我们发现，经过915 nm激光照射和JLD-NPs干预后，颅内肿瘤缩小，说明JLD-NPs可以抑制肿瘤生长，杀伤肿瘤。肿瘤的大小与其增殖水平密切相关。我们进一步检测了ki-67的表达水平，这是一个常见的增殖指标免疫组化结果显示，Light+NPs组颅内肿瘤组织中ki-67的表达水平明显低于其他三组，说明JLD-NPs具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。通过不同组小鼠的ROS生成来测量光动力效应。干性标志物NESTIN(绿色荧光)在肿瘤组织中的表达在Light+NPs组低于其他三组，说明JLD-NPs在915 nm NIR激发下可以抑制肿瘤细胞的干性，影响肿瘤细胞迁移、侵袭等恶性事件的发生。这些结果清楚地证实了JLD-NPs通过促进脑内胶质母细胞瘤细胞的凋亡和抑制胶质母细胞瘤细胞的干性而具有良好的肿瘤抑制能力。
总结
NIR-II aza-BODIPY体系中3,5个位点的julolidine作为aza-BODIPY核心的强供体，构建了一个强大的D−a结构分子。合成了3,5 julolidinyl aza-BODIPY (JLD)，并首次通过x射线晶体学分析证实了其固体结构。自组装的JLD-NPs光热转换效率高，达到79%。915 nm激光照射下的JLD-NPs通过脑立体定向注射促进胶质母细胞瘤细胞凋亡，抑制胶质母细胞瘤细胞的干性，具有良好的肿瘤抑制能力，并影响迁移、侵袭等恶性事件的发生。
参考文献
https://doi.org/10.1021/acsmaterialslett.4c01447
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