内容提要
单粒子跟踪（SPT）已成为监测活细胞中膜蛋白动态的有力工具。SPT的永久标记策略受到光漂白的主要限制，限制了观察时间，并阻碍了对单个活细胞内长期细胞过程的研究。我们使用可交换HaloTag配体（xhtml）作为一种易于应用的活细胞SPT标记方法，并证明了单个活细胞的观察时间延长至30分钟。利用xhtml /HaloTag7标记系统，我们测量了单个活细胞中表皮生长因子受体（EGFR）的配体诱导激活动力学。我们生成了细胞中受体扩散的空间图，报告了受体激活的非均匀分布，以及EGFR激活的空间受限“热点”的形成。此外，我们测量了内质网腔蛋白钙网蛋白在活细胞中的迁移率，并发现了与内质网纳米结构相关的扩散系数。
自标记蛋白标签HT7与可交换HaloTag配体（xHTLs）结合，重复结合和解结合蛋白质靶标，在各种活细胞荧光显微镜应用中被证明可以绕过光漂白。xHTLs由罗丹明染料（或其碳罗丹明和硅罗丹明类似物）和烷烃磺酰胺配体组成，专门将探针靶向到HT7蛋白上。罗丹明染料通过利用荧光两性离子和非荧光螺旋内酯之间的可逆螺旋环化平衡，但具有高度细胞渗透性。与HT7表面结合后，荧光形式稳定，从而诱导信号增加。我们将HT7融合到CD86（一种单体膜蛋白）的胞内结构域，生成表达CD86-HT7的U-2 OS细胞系，并用不同的硅罗丹明（SiR） (x)HTLs靶向蛋白质标签。我们测量了单个CD86-HT7蛋白在活细胞中的迁移率，并生成了单分子轨迹。然后，我们比较了非共价xHTL （SiR-S5）和共价HTL （SiRHTL）在活细胞中单分子轨迹的发生情况，发现共价SiR-HTL在10 s后已经出现了明显的下降。死突变体dHT7 （D106A）是HT7的正交蛋白标签，用xhtml SiRHy5标记，随着时间的推移，荧光信号的保存情况非常相似。在不表达HT7融合蛋白的U-2 OS野生型细胞的对照实验中，所有测试的HT7配体与质膜的非特异性结合都很低。为了评价用于扩散分析的xhtml - ht7 /-dHT7标记概念，我们比较了CD86融合物与共价标记CD86- ht7的扩散系数和扩散模式。与所使用的halotag -配体组合无关，扩散系数和流动分数的分布相似，平均扩散系数约为。0.3µm2 /s和约7%的不可移动颗粒。接下来，我们确定了SiRlabeled配体的轨迹寿命，并发现相当相似的值为0.94±0.03 s (SiR-HTL), 0.93±0.04 s （SiR-S5）和0.87±0.02 s (SiR-Hy5)。
接下来我们评估了荧光团对扩散分析的影响。为此，我们使用与高荧光罗丹明染料JF585偶联的xHTLs，测量了CD86-HT7/-dHT7的扩散特性，发现非常相似的扩散系数约为0.3µm2 /s。与SiR-xHTLs相比，我们发现JF585-S5和JF585-Hy4的不可移动颗粒比例有一些小的变化。这些结果表明，扩散系数和扩散模式在很大程度上与所测试的荧光团和配体的类型无关。在SPT实验中，弹道寿命决定了均方位移（MSD）扩散分析的准确性。对于可交换标记，如xHTLs，它取决于i)与HT7/dHT7蛋白的结合时间，ii)荧光团光漂白，以及iii) HT7/dHT7蛋白的潜在光损伤。SiR-S5、SiR-Hy5和SiR-HTL的轨迹寿命相似，为0.87-0.94 s（图1G，表S3）。xhtml的绑定时间约为2秒（SiR-S5）和1秒（SiR-Hy5）。这表明SiR-S5的轨迹寿命更多地取决于蛋白标签的荧光团光漂白或光损伤，而SiR-Hy5的轨迹寿命也受到与dHT7结合时间较短的影响。jf585 - xhtml的轨迹寿命比sir标记的xhtml短（0.6 s）。这表明这里的主要贡献是荧光团光漂白。随着时间的推移，jf558xhtml的荧光信号几乎保持不变，表明在标签处不断交换。总的来说，在这项工作中确定的xHTLs的轨迹寿命与荧光团标记的纳米体或配体相似。接下来，我们将HT7或dHT7融合到细胞内二聚体膜蛋白CTLA-4和的结构域，并在稳定表达融合蛋白的活U-2 OS细胞中进行SPT实验。同样，随着时间的推移，我们观察到荧光信号只有轻微的减少，并且发现CTLA-4融合物的扩散特性对于各种xhtml -fluorophore/HT7组合是相似的。总之，xhtml - ht7 /-dHT7系统结合SPT实验提供了关于蛋白质扩散的可靠信息，同时带来了随着时间的推移信号损失最小的额外好处。我们观察到，xhtml标记在细胞中产生了均匀的单分子轨迹分布，而html标记在细胞边界产生了更多的轨迹，这是SPT实验中经常看到的现象。为了量化这一观察结果，我们测量了活细胞边缘的荧光信号，并将其与剩余的细胞表面积进行了比较。对于可交换探针SiR-S5，信号在整个细胞表面积上是恒定的，而对于共价配体SiR-HTL，荧光信号在细胞边界处增加，表明蛋白质浓度更高。我们将细胞边界荧光强度的增加归因于共价HTLs在基膜成像领域的光漂白，以及HTLHT7通过从顶膜扩散到细胞边界的补充。
出于保存荧光信号和轨迹密度的目的，我们尝试利用xhtml /HT7在单个活细胞中建立较长的观察时间，对靶蛋白进行重复连续标记。我们使用xHTLs SiR-S5和SiR-Hy5在活细胞中对HT7/ dht7标记的CD86进行了长达20分钟的长期SPT实验。我们发现用可交换的SiR-S5标记的CD86-HT7在活细胞中每次产生恒定数量的轨迹，而用共价SiR-HTL标记的CD86-HT7的密度迅速下降。随着时间的推移，检测到的单分子信号证实了这一发现，共价SiRHTL的信号迅速下降，而交换配体的信号保持在较高水平（SiR-Hy5），甚至几乎不变（SiR-S5）。这些发现使xhtml有资格用于活细胞中的长期SPT实验和扩散景观的空间映射。受体的迁移率可以作为监测功能状态的读数。在受受体靶向配体刺激的细胞中，较慢的扩散或固定可能与激活相关。由于激活发生在几分钟的时间尺度上，因此迄今为止，单细胞SPT实验的可获得的观察时间对于监测单个细胞中的受体激活是有限的。这已经被几个细胞的顺序成像和SPT数据的时间平铺所绕过。我们认为xhtml /HT7标记可以直接监测受体激活。我们测量了瞬时表达的表皮生长因子受体（EGFR）在其天然配体EGF刺激前后的扩散特性。EGFR是一种膜受体，已被各种SPT方法广泛研究我们将HT7融合到EGFR的c端（细胞内）位点，用SiR-S5标记，并在单个活的U-2 OS细胞中进行SPT实验。首先，我们计算了静息和egf刺激细胞20 s的扩散系数和模式。我们观察到，经EGF处理后，扩散系数降低（从0.245±0.004µm2 /s降至0.158±0.003µm2 /s），固定EGFR受体增加（从6.9±0.2%降至10.1±0.4%）。这些发现与先前发表的研究报告一致，在未刺激或egf刺激的细胞中，扩散系数分别为0.02-0.5µm2 /s或0.005-0.29µm2 /s。在受egf刺激的细胞中，扩散系数的降低归因于EGFR二聚化和活化。
我们在活细胞中进行了EGFR-HT7的SPT实验，观察时间延长至30分钟，并分析了其扩散特性。我们量化了未处理细胞和egf处理细胞中移动EGFR-HT7随时间的扩散系数，并将其与CD86-HT7进行比较。我们发现EGFR-HT7和CD86-HT7在30 min内扩散系数持续下降，这可能是轻微光毒性作用的结果然而，EGFR- ht7在egf处理过的细胞中，扩散系数的下降要强烈得多，尤其是在前10分钟。为了提取EGFR的激活动力学，我们使用未经处理的EGFR- ht7的扩散曲线作为基线，并从egf处理过的细胞中EGFR- ht7的扩散曲线中减去它。这给出了未经处理和egf刺激的EGFR-HT7扩散系数的差异图，在大约5-10分钟时，扩散系数下降，随后恢复。这与在单个活细胞中直接测量的egf处理后的EGFR激活动力学相对应，与报道的细胞生物学数据相匹配。我们的方法还允许我们在空间上绘制EGFR激活发生的膜位点，而不会由于例如。受体内化。我们发现固定的EGFR-HT7在不同时间点的分布不均匀，并且出现亚微米大小的局部“热点”，在短时间内短距离积聚了几个受体。这样的“热点”表明存在信号中心优先建立的膜区域，并且可能通过网格蛋白包被的凹坑发生内吞作用。用衍射极限显微镜在活细胞中发现了类似大小的“热点”。EGFR/HER2异源二聚体的受体激活分布也不均匀。
我们展示了长期的双色SPT，得益于两个正交HaloTag变体，这两个变体之前在双色超分辨率显微镜中作为正交标签操作。将EGFR-HT7和CD86-dHT7共转染到U-2 OS细胞中，并使用两个正交交换配体SiR-S5和JF585-Hy4在活细胞中同时进行追踪。
我们对细胞内蛋白进行了SPT实验，通过将HT7与钙网蛋白(CalR)-KDEL序列融合，将其靶向内质网（ER）的管腔。我们记录了长采集时间的单蛋白轨迹，发现扩散系数与先前报道的值相似。我们观察到内质网节点上有限的、较慢的扩散积累（0.14±0.04µm2 /s）和沿内质网小管的较快扩散（0.36±0.04µm2 /s），与之前的报道一致。这证明了我们的方法对细胞内蛋白质长期跟踪的适用性。
总结
我们引入了自标记蛋白标签HaloTag7 （HT7）和dHaloTag7 （dHT7）与弱亲和力和可交换荧光基团配体（xHTLs）结合，用于单个活细胞的长期SPT。延长的观察时间使得单细胞SPT实验可以持续几十分钟。这有利于观察细胞过程，如受体激活在同一个体活细胞。xHTL/HT7标记对受益于工程细胞系和HT7融合蛋白的可用性，并且不限于细胞外靶点。
参考文献
https://doi.org/10.1002/anie.202413117
分子诊断试剂一站式解决方案
分子探针之声团队面对客户的个性化需求提供（半）花菁，二氢吡咯氟硼，酞菁/卟啉，苯并噻二唑，罗丹明，荧光素，四苯乙烯，克酮酸，萘酰亚胺，等可见/近红外（二区）荧光/光声，AIE，药物释放等荧光探针，并提供荧光染料溶液性质研究和细胞/活体的成像和治疗相关课题设计与外包服务。如有任何需要，请联系陈老师(微信号:18506228039)或关注卓欣雅科技公众号
分子探针之声建立了“分子探针科研交流群”，可以添加小编好友(微信号:18506228039，请备注：姓名-单位-研究方向)，邀请入群。
若您自制的材料可以入驻Xprobe平台，添加小编为好友(微信号:18506228039，请备注：入驻Xprobe)。
