内容提要
我们报道了两种阳离子荧光抗癌药物（TriPEX-ClO4和TriPEXPF6）能够通过血脑屏障渗透，通过诱导细胞凋亡和铁下垂来有效治疗GBM。这些聚集诱导发射（AIE）活性物质特异性靶向线粒体，有效触发ATF4/JNK/ alix调控的细胞凋亡和gpx4介导的铁凋亡。它们迅速诱导大量线粒体衍生的空泡化，伴随着活性氧的产生，线粒体膜电位下降和细胞内Ca2+超载，从而破坏代谢并诱导非凋亡细胞死亡。TriPEX-ClO4和TriPEX-PF6成功穿过血脑屏障靶向原位胶质瘤，并在静脉注射后启动有效的协同治疗。我们的AIE药物成为抗耐药GBM的先锋细胞凋亡诱导剂，与替莫唑胺（20天）相比，在耐药GBM小鼠中显著延长生存期，最长可达40天。
AIEgens的结构表征及光学性质
通过单晶结构分析，成功地确定了TriPEX-ClO4、TPEX-ClO4、TPEX-PF6的结构。这些化合物在DMSO中表现出相似的吸收，在548 nm左右达到峰值。由于四苯基乙烯是众所周知的转子，它们在DMSO中的荧光可以忽略不计，荧光量子产率（QYs）小于0.3%，这是由于自由分子运动引起的强烈的非辐射跃迁。然而，在DMSO溶液中加入难溶性甲苯后，这些化合物的红色荧光强度略有增加，然后由于聚集体的形成和分子内运动的限制，当甲苯含量达到90%时，这些化合物的红色荧光强度被增强，这些数据证实我们合成的分子属于AIEgen家族。
线粒体靶向对肿瘤细胞的高选择性毒性
我们在常见的HeLa和U251-TR细胞系中评估了四种AIEgens的抗肿瘤活性，以鉴定AIEgens。所有AIEgens对HeLa细胞和U251-TR细胞均表现出明显的浓度依赖性毒性。在10 μM浓度下，TPEX-ClO4的细胞死亡率分别为77.1% （HeLa细胞）和79.5% （U251-TR细胞），高于TPEX-ClO4 （HeLa和U251-TR细胞分别为37.0%和24.1%）。同样，TPEX-PF6的细胞死亡率分别为62.2% （HeLa细胞）和69.5% （U251-TR细胞），高于TPEX-PF6 （HeLa和U251-TR细胞分别为33.1%和25.3%）。表明空间位阻越小，抗癌活性越高，而反阴离子的影响可以忽略不计。随后，我们选择TriPEX-ClO4和TriPEX-PF6作为靶向分子，研究它们的线粒体靶向治疗机制。在共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）下，通过AIEgens和线粒体特异性探针MitoTracker Green （MTG）的荧光共定位，检测了HeLa和U251-TR细胞的靶向线粒体。如图所示，AIEgens的红色荧光清晰地勾勒出圆形和细长的线粒体，并与MTG的绿色荧光（黄色）表现出良好的重叠，这可以从它们的高Pearson相关系数（0.90−0.92）中看出。这些数据证明了TriPEX-ClO4和TriPEXPF6在两种肿瘤细胞系中具有优越的线粒体靶向能力。并在连续激光照射下对其光稳定性进行了评价。与MTG相比，TriPEX-ClO4和TriPEX-PF6表现出优异的光漂白抗性。这一特性有利于这些基因在很长一段时间内监测线粒体形态的变化。
揭示抗癌机制
丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是细胞凋亡的阳性信号转导途径之一，包括cJun n-末端激酶（JNK）、细胞外信号调节激酶（ERK）和p38.16,22这种细胞死亡模式也受到多功能适配蛋白AIP-1/Alix的抑制。57,58此外，细胞凋亡常伴有Ca2+的内流和超载、氧化还原稳态破坏和代谢失衡为了探索细胞凋亡以外的细胞死亡类型的潜在分子机制，我们检测了HeLa和U251-TR细胞与AIEgens和各种抑制剂孵育的存活率，包括凋亡抑制剂（ZDEVD-FMK，称为DEVD）、3-甲基腺嘌呤（3-MA，自噬抑制剂）、坏死他汀-1 （Nec-1，坏死抑制剂）、60、61和铁他汀-1 （fe -1，铁凋亡抑制剂）。毒理学结果显示，除了fe -1治疗组的改善外，存活能力的变化可以忽略不计，这表明强凋亡伴随着弱铁凋亡，而不是其他机制。我们使用定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和Western blot检测了参与paraptosis/ferroptosis协同途径的关键基因和蛋白的表达。正如预期的那样，两种细胞类型的相对mRNA结果显示alg -2相互作用蛋白X （Alix）和谷胱甘肽过氧化物酶4 （GPX4）的表达水平下降，同时ATF4和p-JNK的表达水平升高。同时，评估凋亡相关的p38和p-p38、p-ERK和er相关Chop的蛋白水平。结果显示，paraptosis独立于凋亡，对ER和erk介导的MAPK通路无明显影响。此外，为了进一步消除这两种AIEgens诱导细胞凋亡的可能性，我们采用典型的化学治疗药物阿霉素（DOX）作为细胞凋亡的对照组。我们比较了DOX和我们的患者的cleedcaspase -3和cleedparp水平。结果表明，DOX触发高水平的凋亡信号，而两种AIEgens仅引起可忽略不计的变化。这些数据进一步证实了所涉及的细胞死亡途径与凋亡方式无关。
由于上述途径，两种AIEgens诱导细胞外钙内流和细胞内钙过载，导致磷酸耗竭、ATP产生减少和代谢中断。因此，流式细胞术分析和相应的定量显示，间隙2期（g2期）/有丝分裂期（m期）的细胞比例增加，在TriPEX-ClO4组中平均为26.2%，在TriPEX-PF6组中为26.4%，在PBS组中为14.4%，显示出有效的细胞周期阻滞。综上所示，TriPEX-ClO4和TriPEX-PF6通过ATF4/JNK/ alix介导的凋亡途径和gpx4引导的铁凋亡途径触发HeLa和U251-TR细胞的线粒体靶向细胞死亡。
皮下HeLa肿瘤模型的体内治疗效果评价
由于TriPEX-ClO4和TriPEX-PF6具有显著的体外抗肿瘤作用，我们对其在体内对常见HeLa肿瘤的治疗效果进行了评价。我们首先根据图所示的治疗时间，在皮下HeLa荷瘤小鼠模型中评估了它们的抗癌活性。通过荧光成像监测这些AIEgens的肿瘤靶向能力。在静脉注射后4 - 6小时观察到这些AIEgens的最高荧光强度，对应于肿瘤中最显著的靶向积累。尾静脉注射5个周期（每2天1次）后，苏木精-伊红（H&E）和Ki67免疫组化分析图像显示肿瘤消融明显，增殖受到抑制。此外，Alix和GPX4的下调以及ATF-4和p-JNK的上调证实了细胞凋亡和铁凋亡的机制与体外实验结果一致。因此，我们的AIEgens诱导的协同凋亡和铁下垂过程产生了显著的肿瘤抑制作用，只有微不足道的体重减轻。此外，各组主要器官的H&E图像未见明显病理异常和细胞炎症，表明AIEgen治疗具有良好的生物安全性。综上所述，这些结果表明TriPEX-ClO4和TriPEX-PF6是两种安全有效的抗HeLa肿瘤药物，通过与细胞凋亡和铁下垂相关的协同途径。
总结
在本研究中，我们成功合成了四种阳离子杂蒽基AIEgens，即TriPEX-ClO4、TriPEX-PF6、TPEX-ClO4和TPEX-PF6，具有不同的四苯基乙烯偶联方式和反阴离子，研究了它们的抗癌效果和血脑屏障通透性。在这些AIEgens中，TriPEX-ClO4和TriPEX-PF6具有相对较小的位阻水平，特异性对癌细胞比健康细胞表现出较强的细胞毒性。这两种AIEgens特异性靶向线粒体，有效触发ATF4/JNK/ alix参与的凋亡和gpx4介导的铁凋亡途径。具体来说，它们迅速诱导大量线粒体衍生的空泡化、活性氧的产生和细胞内Ca2+超载，导致代谢紊乱和最终的细胞死亡。值得注意的是，TriPEXClO4和tripexpf6的平衡两亲性增强了它们的血脑屏障通透性，通过协同凋亡和铁凋亡途径实现对GBM的高效治疗。与tmz治疗组（20天）相比，这种独特的治疗方法显著延长了U251-TR荷瘤小鼠的生存时间，最长可达40天。这项工作不仅为耐药原位GBM的诊断和有效治疗开辟了新的领域，而且为设计和合成优质的诱导淋巴细胞凋亡的抗癌药物提供了有价值的见解。我们的荧光激活剂在基础和临床疾病治疗应用中具有巨大的潜力，未来将开发用于诱导协同凋亡和铁凋亡。
参考文献
https://doi.org/10.1021/jacs.4c07785
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