内容提要
我们报道了一种扭曲平面的分子策略，通过超声诱导j聚集来开发用于光疗的供体-受体（D-A）型J聚集体。以螺旋桨聚集诱导发射（AIE）基团为扭曲亚基，噻吩为平面π桥，MTSIC中最优的扭曲-平面π相互作用诱导了适当的滑移角和j -团聚体的形成，使吸收从624 nm红移到790 nm。相反，较短的π-平面度导致了非晶态聚集，而伸长促进了电荷转移（CT）耦合的j -聚集。结果表明，超声能有效地控制MTSIC的自组装行为，使其从无定形聚集体转变为h -中间体，最终转变为稳定的J -聚集体。用脂质peg包封后，得到的j点比非晶态点表现出更强的光疗效果，包括亮度、活性氧（ROS）的产生和光热转化，提供了更好的癌症光疗性能。
分子设计与光物理性质
在D-A型荧光团中，供体和受体段之间的偶极-偶极相互作用通常导致反平行堆叠，具有大的滑移角，如h聚集。当位阻较大时，缺乏足够π-π相互作用的D-A型分子容易形成非晶态聚集体。因此，优化π共轭和空间位阻之间的平衡是诱导D-A型小分子中j聚集的关键和挑战。在这项工作中，选择了具有扭曲分子几何结构的标志性AIE片段MTPA作为电子供体，它也作为空间位阻诱导分子间π-π堆积平面之间的滑移堆积。此外，还选择了缺电子的2-（3-氧-2,3-二氢- h -茚-1 -乙基）丙二腈（IC）和噻吩(S)单元作为电子受体，并选择-桥，其中IC上的羰基可以与S单元形成分子内S···O=C构象锁，以减小扭转角，从而保证了分子骨架的基本平面度和充分的π-π相互作用。合成了3种调节π-共轭长度和π-π相互作用行为的S数为1 ~ 3的分子，分别为MTIC、MTSIC和MTSSIC。采用Knoevenagel缩合反应一步法合成了MTIC。首先用紫外-可见光谱和光致发光（PL）光谱研究了其光物理性质。随着S数的增加，它们的吸收峰（在四氢呋喃（THF）中）呈现出从MTIC的589 nm到MTSIC的624 nm和MTSSIC的628 nm的红移。同样，MTIC、MTSIC和MTSSIC的最大发射波长分别位于632 nm、975 nm和990 nm。
声波诱导的J聚集行为
在没有超声作用的情况下，增加fw只会导致吸收带略微变宽，这可能是由于纳米聚集体内部分子间相互作用增强所致。初步研究了声波诱导的潜在j聚集在70%的情况下，这一条件落在ouzo区域内，有利于纳米结晶。超声作用在10 min内对MTIC的吸收光谱变化最小。有趣的是，MTSIC在623 nm到790 nm的吸收波段显示出明显的深色偏移，表明有很强的j聚集作用。进一步监测发现，转变发生在2 min内。MTSSIC表现出明显不同的现象，超声后主吸收峰从634 nm红移到688 nm，出现440 nm的吸收带，提示h -聚集体和j -聚集体共存。进一步的监测显示，MTSSIC在4分钟内首先从634 nm蓝移到440 nm，表明h -聚集体的中间形成，然后在6分钟转化为ct耦合的j -聚集体（CT-Jaggregates）。值得注意的是，MTSIC在790 nm处表现出j波段，而MTSIC仅为688 nm，这表明MTSIC的j聚集更优。这些结果表明，超声有效诱导了有序堆积，π共轭长度显著调节了它们的组装行为。具有平衡的扭曲平面π共轭的MTSIC表现出最佳的j聚集，而没有充分平面共轭的MTIC表现出最低的声致结晶能力。π平面度过长的MTSSIC具有较高的ct - j聚集力。同时测量了超声处理前后的发射光谱（fw = 70%）。由于AIE效应和j聚集增强发射的共同作用，MTSIC的荧光增强系数达到了46.1，而MTIC和MTSSIC在没有最佳j聚集的情况下，荧光增强系数分别为2.9倍和6.5倍。进一步探讨了溶剂效应。当fw值在60% ~ 75%范围内变化时，MTIC在10 min的超声作用下，吸收波段发生了轻微的蓝移（从566 nm到547 nm），随着超声作用时间的增加，吸收波段蓝移到503 nm，进一步呈现hagaggregation趋势。MTSIC和MTSSIC表现出截然不同的j聚集现象。Abs790/Abs624图谱显示，超声时间可以很好地调节MTSIC的j -聚集，超声时间越短，j -聚集速度越快，这是由于分子排列更松散，有利于分子重排。有趣的是，在80%的fw下，在4min出现了440 nm的新吸收带，表明Haggregates的参与。然而，h波段很快消失，随后被j波段所取代，这表明MTSIC可能经历了中间从无定形到h -聚集体再到j -聚集体的转变过程。
受控声波诱导的j聚集
受声波作用下潜在的非晶h - j聚集体转变的启发，我们选择了MTSIC来进一步研究声波诱导的j聚集过程。首先在室温下监测了MTSIC在四氢呋喃/水混合物中未经超声处理的自组装过程。在所有测试fw中，MTSIC在10分钟内显示出相似的吸收光谱，这表明超声对结晶至关重要。将时间延长至60 min，在波长为60%和70%时，MTSIC在790 nm左右逐渐出现吸收肩，说明适当波长下MTSIC具有j聚集倾向。进一步将温度升高到40℃，10 min内MTSIC的吸收光谱变化也很小，说明超声过程中产生的热量不足以实现非晶向j团聚体的转变。因此，MTSIC需要来自超声的额外能量来克服分子重排和j聚集体形成的能量障碍。此外，使用探头声纳器增加声波功率密度（125 W）也可以成功诱导j聚集，即使在高达99%的fw下，这表明声波能量输入对于克服非晶向j聚集转化的能量障碍至关重要。在高fw值时，由于分子堆积更紧密，j聚集过程减慢。在fw = 80%的条件下，对超声诱导j聚集的机理进行了研究。MTSIC在超声作用4 min内迅速形成h -聚集体，然后转化为j -聚集体。考虑到h -团聚体和j -团聚体的热力学稳定性差异，在此过程中首次评估了温度效应。低温（如25°C）稳定了h -聚集体，阻止了j -聚集体的转变，440 nm处的吸收带上升，从628 nm到614 nm的吸收带变尖并略有蓝移。此外，获得的h -聚集体可以在室温下储存超过8个月。另一方面，高温（例如40°C和50°C）促进了j -聚集体的直接形成，而没有中间h -聚集体的观察，因为更高的温度提供了超过h - j势垒的额外活化能。然而，60°C的超声未能诱导H/J吸收带，可能是由于THF快速挥发。
J点的制备与表征
为了提高胶体稳定性和生物相容性，选择两亲性聚合物DSPE-PEG2000作为包封基质，制备基于MTISC j聚集体的纳米点（J-dots）。制备过程包括将含有MTSIC和DSPE-PEG2000的THF溶液加入到水/THF体积比为4的水溶液中，然后进行10分钟的超声处理。同样，具有非晶聚集体的MTSIC纳米点（A-dots）也只需要2分钟的超声就可以制备出来。j点和a点的水动力直径相似，分别为~34.8 nm和~52.6 nm。TEM（透射电子显微镜）显示它们的形状均匀，j点的尺寸为25.5 nm， a点的尺寸为~ 39.2 nm。J-dots和A-dots也具有相似的齐电势，分别为-28.6 mV和-31.5 mV，这归因于向外的PEG壳层，证明了成功的纳米封装。它们还表现出优异的胶体稳定性，在水溶液中储存7天后，水动力直径几乎没有变化。粉末x射线衍射（PXRD）分析进一步显示了MTSIC的衍射峰，证实了j点内部的MTSIC晶体性质。J-dots的吸收峰位于790 nm处，与A-dots （620 nm）相比红移了170 nm，与j - aggregates的吸收光谱相似。在790 nm处，J-dots的摩尔消光系数ε为3.45×104 L·mol-1·cm-1，比A-dots （2.13×104 L·mol-1·cm-1）提高了1.62倍。Jdots的荧光强度比以900 nm为中心的a点增强了约20.5倍。不同的ROS探针评价j点和a点的ROS生成能力用2,7二氯二氢荧光素（DCFH）评价总ROS生成，在808 nm激光照射下，J-dots的DCFH荧光增强因子高达~115，比A-dots和商用PS吲哚菁绿（ICG）高近6.9倍和17.0倍，表明J-dots具有更优越的ROS生成能力。有趣的是，在660 nm激光照射下，J-dots比A-dots的ROS生成能力更强，在660 nm激光照射下，A-dots的吸光度更强，证明J-aggregation可以增强ROS的生成。用9,10-蒽二基双（亚甲基）二丙二酸（ABDA）、二氢膦胺123 （DHR123）和羟基苯基荧光素（HPF）作为单线态氧（1O2）、超氧阴离子（O2•−）和羟基自由基（OH）探针进一步研究ROS的类型。J-dots和A-dots都不产生ii型ROS (1O2)，在808 nm下也不产生OH。相比之下，DHR123的荧光增强证明了O2•−生成能力，并且J-dots的O2•−生成能力比a -dots高5.2倍。此外，在光照射下，与非晶态聚集体相比，Jaggregates表现出更高的光电流，证明了它们更强的电荷分离能力，促进了电子与周围氧气的转移，生成O2•−。事实上，在808 nm激光照射下，MTSIC J-dots是少有报道的优秀的i型光敏剂之一。通过对单体和j -二聚体的TD-DFT研究来阐明ROS生成增强的原因。MTSIC调光剂表现出更低的单线态激发态（S1）和三重态激发态（T1）能隙（ΔES1-T1）和更高的自旋轨道耦合（SOC）值，这表明Jdots的ISC过程更有效，因此具有更好的ROS生成能力。在808 nm激光照射下，评价了j点和a点的光热转换能力。低MTSIC下的j点浓度为40g/mL时，a -dots的温度升高达到了33.5℃，在辐照后10 min内达到了64.7℃，而a -dots仅达到了36.8℃的高原温度，温度升高为11.8℃。热红外图像证实了808 nm激光照射下j点的温度升高。j点还表现出浓度和功率相关的光热效应。计算得出Jdots的光热转换效率为40.67%，超过了商用ICG分子的光热转换效率，表明J-dots是一种很有前途的808 nm激光驱动光热剂。此外，Jdots还表现出优异的光热稳定性，明显优于ICG。在808 nm激光照射下，与ICG在相同条件下的快速分解相比，j点和a点的吸光度几乎没有变化，进一步验证了j点和a点的光稳定性。
J点的体外光疗
HeLa细胞孵育24 h后，用2700二氯双氢荧光素（DCFH-DA）探针检测J-dots产生的细胞内ROS。未经激光照射的j点、a点和磷酸缓冲盐水（PBS）组均未显示出明显的绿色荧光。808 nm激光照射后，J-dots + L （L为808 nm激光照射）组细胞内出现了显著的绿色荧光，而其他组均无，证实了808 nm激光照射下J-dots细胞内ROS生成能力更强。采用甲基噻唑基二苯基溴化四氮唑（MTT）法评价808 nm激光照射下的肿瘤杀伤效果。j点和a点的暗毒性均可忽略不计，表明它们具有良好的生物相容性。在808 nm激光照射下，J-dots处理的细胞显示出显著的杀瘤效果，其半抑制浓度（IC50）值为2.3µg/mL。然而，a -dots的癌细胞杀伤能力非常差，在808 nm激光照射下，在20µg/mL的高浓度下，a -dots仍能维持80%的细胞活力。用绿色荧光钙黄素-乙酰氧基甲酯（AM）和救赎碘化丙啶（PI）进行活细胞/死细胞染色，进一步观察到J-dots + L组以牺牲绿色荧光为代价的强红色荧光，与A-dots+ L组的高绿色荧光细胞群形成鲜明对比，证明J-dots光疗效果更好。流式细胞术分析进一步显示，J-dots + L组细胞凋亡率为95.74%，其中早期凋亡率为61.3%，晚期凋亡率为31.44%。这一结果与其他组中较高的存活细胞百分比一起证实了J-dots优异的光疗性能。
J点的体内抗肿瘤光疗
将4T1肿瘤细胞接种于雌性BALB/c小鼠右后肢，建立荷瘤小鼠模型。当肿瘤达到适当的90 mm3时，将小鼠随机分为4组（每组n = 5只），分别为PBS、J-dots、PBS + L、J-dots + L. J-dots或PBS，在所选组小鼠中注射J-dots或PBS，在注射后2 h进行808 nm激光照射。用热像仪记录肿瘤的温度变化。J-dots + L组的肿瘤温度在10分钟内达到60.2°C的平台期，而PBS + L组的最低温度上升为1.9°C。然后连续监测小鼠肿瘤体积和体重16 d。J-dots或单独激光照射的抑制作用最小，J-dots、PBS + L组的肿瘤生长曲线与对照PBS组相似。与此形成鲜明对比的是，J-dots + L组表现出优异的抗肿瘤效果，5个肿瘤中有4个几乎完全被根除。在第16天提取的肿瘤的权重也证实了j点的优越的肿瘤消除性能。此外，在整个过程中，所有组的体重都没有明显变化，证实了这些斑点和处理的生物安全性。然后使用苏木精和伊红（H&E）染色、Ki-67和末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色进行组织学和免疫组织化学分析。H&E染色显示J-dots + L组细胞明显损伤，核皱缩，细胞腔增大。Ki-67染色图像显示，J-dots + L组的绿色荧光最弱，表明J-dots和808 nm激光照射后，这些肿瘤细胞丧失了增殖能力。同样，TUNEL免疫荧光染色也显示J-dots + L组细胞凋亡水平最高。在健康小鼠上进一步评价了J-dots的生物安全性和生物相容性。健康BLAB/c小鼠静脉注射PBS或J-dots，注射后第7天进行血液学和血液生化分析。所有血液学参数均在正常范围内，提示j点不会造成严重的功能损害。同样，血清肝肾功能参数均与PBS对照组相当，提示全身毒性风险可忽略不计。
总结
我们在此开发了一种新的扭曲平面分子工程策略，与声诱导j聚集策略一起开发用于光疗的D-A型小分子j聚集体。通过改变以AIE片段为扭转单元的平面π共轭长度来调节分子的聚集行为，从而调节扭曲和平面的分子几何平衡。具有最佳扭曲-平面π相互作用的MTSIC有利于j -聚集体，而π平面度的缩短导致非晶聚集体，而π平面度的延长导致ct - j聚集体的高倾向。超声可有效诱导MTSIC的j聚集，其过程包括从无定形聚集体到中间h聚集体，再到稳定j聚集体的转变。通过优化超声诱导j聚集过程的关键参数，获得了一分子（MTSIC）三种不同且稳定的聚集体（无定形、H-和j -聚集体）。通过DSPE-PEG2000包封制备的J-dots具有比A-dots更好的光物理性能，包括吸收带红移（从620 nm到790 nm），摩尔消光系数增加（1.6倍），荧光增强（20.5倍），ROS生成增强（6.9倍），808 nm激光照射下光热效应提高（40.67%）。体外和体内实验均表明Jdots具有显著的抗肿瘤潜力。超声诱导的j -聚集策略为H/ j -聚集的可控自组装过程提供了重要的理解。
参考文献
https://doi.org/10.1002/anie.202419428
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