内容提要
本文首次提出了一种氨基功能化策略，以构建具有NIR-I至NIR-II可调发射的肾靶向荧光团NHcy库。其中，NHcy-8是第一个没有肾脏清除片段的小分子NIR-II染料，专门用于肾脏靶向成像。在这类NIR-II荧光基团的基础上，开发了首个NIR-II小分子肾脏靶向pH探针NIR-II-pH，该探针在静脉注射后表现出理想的肾脏分布，只有在酸中毒激活后才会荧光。利用NIR-II- ph对顺铂诱导的肾脏疾病模型进行体内荧光/光声成像，发现随着疾病进展代谢性酸中毒日益严重，能够比临床方法提前36 h（顺铂组）敏感地检测到酸中毒的发生。因此，本研究引入了一种实用的NIR-II肾靶向探针，为指导肾靶向NIR-II荧光团作为肾脏疾病的诊断辅助工具提供了有用的分子蓝图。
肾靶向染料的性质研究
肾靶向染料NHcy-2-8的详细合成过程和表征数据。利用紫外可见吸收和荧光光谱测量了NHcy-1 ~ 8的光学性质。NHcy-8在DMSO中的最大荧光发射达到937 nm，落在NIR-II窗口内，非常适合NIR-II生物成像应用。荧光成像前，用HK-2细胞检测NHcy1-8染料的生物相容性。与NHcy-1-8（0−25 μM）孵育24小时后，HK-2细胞表现出最小的细胞毒性，表明具有良好的生物相容性。为了验证肾脏靶向染料设计的可行性，我们将NHcy-1 ~ 8静脉注射到活小鼠中，并进行2小时的实时荧光成像，以跟踪染料在小鼠体内的积累和代谢谱。结果显示，经尾部静脉注射后，染料迅速分布于肾区，并在5 min内达到最大信号强度，说明染料在活体小鼠体内分布迅速。荧光t1/2为≈75 min，确保了染料在肾脏中停留一定时间，从而为肾脏疾病的检测提供了足够的时间。在约2小时内，染料在小鼠体内发出的荧光信号强度下降到原来的三分之一左右。在器官解剖图像中，很明显，染料在肾脏中明显积聚，在其他器官中几乎没有检测到荧光信号，强调了NHcy对肾脏靶向的特异性。这些染料可以迅速靶向肾脏，并有望实时监测肾脏疾病，因为它们能够在NIR-I和NIR-II荧光窗口中工作。我们研究了与仅在NIR-I区域操作的染料相比，NIR-II染料可实现的组织渗透深度增强，进一步验证了它们在肾脏成像中的潜在优势。我们分别选择NHcy-7和NHcy8作为NIR-I和NIR-II的代表，在体外研究组织渗透深度和信号背景比（sbr）。捕获含有NHcy-7或NHcy-8的毛细管的荧光图像，并覆盖不同厚度的1%脂内脂质。在两个检测窗口，随着脂质内深度从0 mm增加到10 mm，毛细血管的可见性变差。NHcy-7在NIR-I FL波长窗口中观察到较浅的穿透深度（≈2 mm）。相比之下，NIR-II荧光成像在900 nm以上显示出对NHcy-8的大穿透深度（≈6 mm）。此外，NHcy-8的sbr高于NHcy-7。这些发现表明，具有稳定NIR-II FL信号的NHcy-8适合于体内深部组织成像，具有良好的应用前景。为了研究静脉尾给药后NHcy-1-8的药代动力学，采用高效液相色谱法测定其血液半衰期。注射后90分钟，血液中NHcy-1-8浓度降至初始注射剂量（ID）的2%。通过血浆清除动力学的双室分析确定，所讨论物质的消除半衰期（t1/2 /时延）为≈25分钟，表明在小鼠中的消除速度很快。通过对小鼠体内NHcy-1-8的代谢研究，我们证明了肾脏靶向染料设计策略的可行性。为了公平比较，我们还合成了未经氨基修饰的对照染料Hcy-1和Hcy-2，以研究氨基对肾脏靶向功能的影响。
注射NHcy-8后，染料在5分钟内到达肾脏，NIR-II FL信号强度达到峰值。肾背区检测到的NHcy-8荧光信号明显较强。而腹侧肝脏荧光信号较弱，肾脏荧光信号约为肝脏荧光信号的5倍。而另一组小鼠注射Hcy1后，肾背区几乎未见荧光信号。相反，当从腹侧观察时，在肝脏中观察到明显的荧光信号，比肾区强4倍。由于Hcy-2缺乏可识别的荧光信号进行直接可视化，因此使用PA成像来监测积聚。活体小鼠注射Hcy-2后，在肾背区检测到弱PA信号。在观察肝脏腹侧区域时，我们注意到PA信号随着时间的推移逐渐增加，是肾区信号强度的4倍。这表明Hcy-1和Hcy-2不会在肾脏中积累；相反，它们会积聚并被肝脏代谢。为了了解可能的原因，我们首先研究了这些化合物的亲水性。如图所示，肾靶化合物NHcy-1-8的log P值低于Hcy-1和Hcy-2，且均小于1，表明极性高，属于亲水化合物。这一特性使化合物易于成为肾脏靶向，并导致高肾清除率。随后，我们测试了这些化合物的血浆蛋白结合率（PPB）。NHcy-1 - 8的PPB率在20%以下。相比之下，Hcy-1和Hcy-2的PPB率分别为55.8%和55.0%，显著高于NHcy-1-8。这意味着增加对蛋白质吸附的抵抗力可以增强肾脏靶向性，从而改善肾脏清除率。上述实验不仅证明了我们基于氨基酸功能化的肾脏靶向染料设计的可行性，而且突出了其检测肾脏疾病的潜力。
NIR-II-pH探针的合成及体外检测
肾功能不全是住院患者常见的并发症，包括肾毒性药物引起的急性肾损伤和缺血再灌注损伤引起的急性肾功能衰竭，常导致代谢性酸中毒。这种酸中毒可能很严重，并导致各种并发症，如心功能受损、心律失常易感性增高和细胞活动受损。因此，开发直接针对肾小管酸性微环境的快速、无创策略是确保及时进行肾保护干预的必要条件。在这项研究中，我们开发了第一个NIR-II小分子肾脏靶向pH探针NIR-II-pH。该探针在尾静脉注射后表现出良好的肾脏分布，其荧光和PA信号仅在酸中毒时激活。NIR-II-pH的化学结构通过1H和13C NMR谱和质谱证实。
在标准中性条件下，NIR-II-pH在600 nm处出现吸收峰，荧光最小，因为吲哚部分的吸电子能力受到抑制，导致阻断分子内电荷转移（ICT）。然而，在酸性条件下，氮原子发生质子化，从而增强了其吸电子能力。这种改变导致在830 nm处出现一个新的吸收峰，导致NIR-II-pH在937 nm处的荧光强度增加了28倍以上。值得注意的是，测定了NIR-II-pH的pKa为6.6，测试了探针NIR-II-pH在PBS、生理盐水和DMEM中的稳定性，发现在12 h内吸光度几乎没有变化，表明探针具有良好的稳定性，适合检测与急性肾损伤相关的酸性变化。
随后，在不同pH水平的溶液中进行NIR-II FL和PA成像，模拟不同的生理条件。在酸性条件下（pH 5.0）， NIR-II-pH的荧光和PA信号都比碱性条件下（pH 8.0）高出17倍以上。此外，在酸性条件下（pH 5.0）， NIR-II-pH的光声光谱中检测到显著的红移，与吸收光谱的结果一致。此外，NIR-II-pH对其他干扰分析物（包括蛋白质、ROS和金属离子）的荧光响应可以忽略不计，强调了其在酸性条件下的高特异性。通过测量NIR-II荧光信号，探针在pH 5.0和pH 8.0之间表现出明显的可逆性，这归因于氮原子的质子化/去质子化。
小鼠肾缺血再灌注致代谢性酸中毒的体内NIR-II FL/PA成像
肾缺血再灌注（I/R）损伤以肾功能迅速恶化、发病率高、死亡率高为主要临床综合征。肾I/R损伤时，固定酸排泄能力下降，导致小管代谢性酸中毒，加重局部炎症和细胞凋亡，加重肾损害[20]。为了进一步验证NIR-II-pH用于代谢性酸中毒体内可视化的可行性，我们研究了探针NIR-II-pH对I/ r诱导的小鼠代谢性酸中毒的影响（方案2）。研究中使用了三组小鼠：一组进行假手术（假手术组，由未缺血的健康小鼠进行中线剖腹手术组成），另外两组为I/R损伤组（健康小鼠缺血时间不同，分别为15或30分钟，然后再灌注30分钟）注射探针NIR-II- ph (100 μm, 100 μL) 1 h后，假手术组肾区荧光减弱。相比之下，I/R损伤组肾区可见明显的荧光信号。与缺血时间较短（15 min）的I/R损伤组相比，缺血时间较长（30 min）组的荧光信号明显更明显，这可能是由于缺血时间较长导致肾酸清除率降低更大，酸性产物积累增加，肾损伤更严重，因此荧光信号更强。利用探针NIR-II-pH通过PA成像检测肾I/R损伤引起的代谢性酸中毒。静脉注射后不同时间间隔的PA横切面图像。缺血时间较长（30 min）组的PA信号明显高于假手术组和缺血时间较短（15 min）组。具体来说，这些PA信号比假手术组强3倍，比缺血时间较短（15分钟）组强2倍。PA成像结果与NIR-II FL成像结果一致，通过sCr/BUN测量和组织病理学检查证实肾I/R损伤。
总结
利用氨基功能化方法有效地设计和合成了肾靶向荧光团NHcy库，从而实现了NIR-I至NIR-II区域的可调发射。令人兴奋的是，NHcy-8表现出较强的NIR-II荧光和PA信号，具有比NIR-I分子更高的SBR。此外，NHcy-8在活体小鼠中表现出延长肾脏滞留时间（t1/2大于60 min），为肾脏疾病的监测和评估提供了潜在的优势。值得注意的是，NHcy-8代表了第一个小分子NIR-II荧光团，没有专门为肾脏靶向成像设计的肾脏清除片段。基于NIR-II肾吸收荧光团，我们进一步创造了开创性的NIR-II小分子肾脏靶向pH探针NIR-II-pH，用于代谢性酸中毒的高对比度成像，该探针在静脉注射后显示出良好的肾脏分布，并在酸性病理条件下通过氮质子化打开其FL和PA信号。更重要的是，使用NIR-II- ph对顺铂或肾I/R损伤诱导的代谢性酸中毒小鼠模型进行体内NIR-II荧光和PA双模式成像显示，随着疾病的进展，肾酸中毒逐渐增加，可以在临床流行的sCr/BUN水平和组织学检查前至少36小时（顺铂组）早期发现酸中毒。进一步应用NIR-II-pH监测NAC和Que治疗后代谢性酸中毒和肾损伤的恢复程度。
参考文献
https://doi.org/10.1002/adhm.202402828
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