内容提要
我们报告了一种涉及水溶性NIR-II AIEgen的接力型先天免疫激活策略，可显著促进肿瘤治疗。所开发的光免疫治疗纳米平台PTQ@R是由R837和水溶性AIEgen PEG420-TQ通过π-π堆叠构建而成。利用PTQ@R可以实现一次给药两次给药和免疫激活，显著提高了原发性和远处肿瘤的治疗效果。如图所示，PTQ@R可以有效地在肿瘤区域积累进行首次给药，并在NIR-II上对肿瘤深部组织具有突出的荧光成像。此外，在660 nm激光照射肿瘤部位后，PTQ@R可以对肿瘤细胞进行光免疫治疗，诱导ICD，促进肿瘤相关抗原的释放，促进肿瘤区域apc的浸润和激活（第一次免疫激活）。随后，凋亡的肿瘤细胞通过apobd将R837传递给肿瘤区域浸润的apc（第二次给药），进一步激活先天免疫（第二次免疫激活）。最终，两次给药策略可以触发激光照射下的协同接力型先天免疫激活，有效抑制原发和远处肿瘤，防止肺转移，延长荷瘤小鼠的生存期。
合成和光物理研究
通过简单的Suzuki反应合成了OMe-TQ。烷基链的存在有利于防止荧光团之间的分子间π-π堆积，从而提高聚集状态下的荧光强度。在这种情况下，推荐己氧基组提供OC6-TQ。为了使发光素具有良好的水溶性，我们用长聚乙二醇（PEG）链PEG420取代疏水己氧基部分合成PEG420- tq。OMe-TQ、OC6-TQ和PEG420-TQ在四氢呋喃（THF）溶液中的最大吸收波长几乎相同，峰值在660 nm左右。它们都表现出750到1200 nm的宽发射光谱，这为NIR-II FLI的使用提供了条件。随后，在THF/水二元溶液中测量了它们的AIE性质，OC6-TQ表现出更好的AIE性能，这可以解释为己氧基链减少了π-π相互作用。值得注意的是，PEG链的引入显著提高了PEG420-TQ的水溶性。计算PEG420-TQ在THF和水中的相对量子产率分别为1.4%和1.6%。PEG420-TQ的荧光强度随着浓度的增加而逐渐增强。在功率密度为0.3 W cm-2的660 nm激光照射下，PEG420-TQ表现出优异的ROS生成效率，可用于光动力治疗。此外，通过记录不同条件下的温度分布，系统评价了OMe-DPTQ、OC6-DPTQ、PEG420-TQ的光热转化能力。PEG420-TQ表现出最强的PTT能力。与ICG相比，PEG420-TQ在连续五个加热/冷却循环后，在光热稳定性方面表现出压倒性的优势。为了评价PEG420-TQ的光稳定性，在660 nm激光（0.3 W cm-2）照射不同时间下，获得了PEG420-TQ在水中的紫外-可见吸收光谱。
体外PTQ@R光免疫疗法介导的ICD
受PEG420-TQ （PTQ）突出的光热转化和ROS生成能力的启发，我们接下来通过引入有效的TLR-7激动剂R837构建PTQ@R，以增强对肿瘤细胞的杀瘤作用。与PTQ相比，PTQ@R的水动力尺寸从28.2 nm增加到68.1 nm。Zeta电位结果显示，加载R837后PTQ@R的表面电荷没有明显变化，这表明R837通过π-π堆叠被封装在PTQ的核心中。如图所示，与PTQ相比，在PTQ@R中分别在305 nm和318 nm处观察到R837的两个特征吸收峰，说明R837成功加载到PTQ中，构建了PTQ@R。评估PTQ@R在激光照射或不照射下的细胞毒性作用，使用细胞计数试剂盒-8 （CCK-8）和钙cein- am /碘化丙烯（PI）染色分析评估细胞活力。如图所示，PTQ@R在没有激光照射的情况下对4T1细胞没有明显的细胞毒性作用，但在激光照射下却表现出非常高的细胞毒性。在药物浓度为20 μM时，激光（PTQ@R+L）处理PTQ@R组细胞存活率仅为13.30%，而PTQ@R组细胞存活率无明显变化。然后进行Calcein-AM/PI染色，进一步探讨PTQ@R在光照射下的杀瘤效果。对照组、L组和PTQ@R组均可见到亮绿色荧光，说明三组细胞都是活的。相反，PTQ@R+L组可见明显的PI红色荧光，表明PTQ@R能显著促进4T1细胞在光照射下的死亡。用2',7'-二氯荧光素（DCFH-DA）作为探针评估细胞内ROS的产生。PTQ@R+L组DCF的亮绿色荧光清晰可见（图3F和图S36B）。受损肿瘤细胞释放的DAMPs，包括钙网蛋白（CRT）、高迁移率组盒-1 （HMGB-1）和三磷酸腺苷（ATP），被认为是ICD的生物标志物。本研究采用免疫荧光法检测CRT对4T1细胞的影响，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测4T1细胞HMGB1和ATP的分泌。如图3G和S36C所示，与其他各组的微弱绿色荧光不同，PTQ@R+L组明显可见大量绿色荧光，说明PTQ@R在光照下可诱导肿瘤细胞发生ICD，促进CRT的表达，发出“吃我”信号。此外，PTQ@R+L组释放的HMGB-1和ATP水平明显高于其他组（图3H和图3I）。基于上述结果，证明PTQ@R+L（第一次给药）处理4T1细胞可以释放大量DAMPs，有效诱导ICD，从而导致免疫系统的激活（第一次免疫激活）。
PTQ@R介导的光免疫治疗诱导BMDCs和BMDMs的体外活化
为了确认PTQ@R的第二次给药对接力型免疫激活的作用，我们通过离心获得了PTQ@R+L处理后的凋亡肿瘤细胞产生的apobd。图中（插入）的透射电子显微镜（TEM）图像显示，apobd的尺寸约为80 nm，膜结构清晰可见。同样，通过DLS检测apobd的水动力尺寸，结果在200 nm左右。此外，通过HPLC确定了ApoBDs的组成为R83。为了确定接力型先天免疫激活的效果，骨髓源性树突状细胞（bmdc）的成熟被评估为首要步骤。从BALB/c小鼠中分离BMDCs，流式细胞仪分析提取BMDCs的纯度。然后，将BMDCs与不同处理的肿瘤细胞共培养。随后，用流式细胞术评估成熟BMDCs的群体。如图所示，在对照组中仅鉴定出12.50%的成熟dc。同样，L组和PTQ@R组的成熟dc种群分别为15.95%和25.85%。这些结果可能是由于对照组、L组和PTQ@R组的肿瘤细胞既没有进行ICD，也没有通过apobd传递R837。然而，PTQ@R+L组中成熟dc的比例（51.46%）比对照组增加了4.12倍，比PTQ+L组增加了1.45倍（35.52%），这进一步证明PTQ@R可以在光刺激下诱导肿瘤细胞启动ICD，并通过凋亡的肿瘤细胞来源的apobd第二次传递R837实现继发性免疫激活。然后用ELISA法检测DCs与肿瘤细胞共培养培养基中相关细胞因子的表达。如图所示，PTQ@R+L组肿瘤坏死因子α (TNF-α)和白细胞介素6 （IL-6）的分泌量远高于其他组，进一步验证了PTQ@R在光照下通过诱导ICD促进DCs成熟。
4T1荷瘤小鼠体内抗肿瘤作用
为了研究PTQ@R对原发肿瘤的体内抗肿瘤作用，我们通过皮下接种4T1细胞建立单侧4T1荷瘤小鼠模型。据我们所知，肿瘤内注射是治疗皮下肿瘤的一种高度安全有效的给药方式，因为它具有药物在肿瘤部位快速集中和药物全身毒性最小的优点。首先在瘤内注射PTQ@R，然后用660 nm激光照射肿瘤区域，同时用红外热像仪记录肿瘤表面的温度变化。与L组相比，注射PTQ@R后的肿瘤在光照下10 min内温度明显升高，说明PTQ@R在体内也具有良好的光热转化能力。然后将单侧4T1荷瘤小鼠随机分为不同治疗组。如图所示，PTQ@R+L组14%的小鼠在给药后100天存活且无肿瘤，而Control、L和PTQ@R组小鼠均死亡。此外，我们观察到，在14天内，Control、L和PTQ@R组小鼠的肿瘤体积逐渐增大，而PTQ@R+L组小鼠的肿瘤体积明显减小。
总结
我们构建并合成了一种水溶性AIEgen， PEG420-TQ，它具有良好的NIR-II FLI、ROS生成和光热转化能力，是抗肿瘤治疗的理想候选物。本研究构建并开发了一种基于PEG420-TQ、免疫佐剂R837 （PTQ@R）辅助的接力型先天免疫激活策略，通过PTQ@R介导的光免疫疗法启动肿瘤细胞进行ICD，从而促进免疫细胞的浸润和先天免疫细胞的激活，从而实现首次先天免疫激活。随后，通过apobd给药R837实现第二次先天免疫激活，导致先天免疫系统进一步激活，最终引发全身抗肿瘤免疫应答。
参考文献
doi: 10.7150/thno.95724
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