内容提要
本研究创新性地采用供体工程策略来开发从近红外（NIR） I到近红外（NIR） II发射的半花青素染料（Hcys）。将性能优异的Hcy包裹在两亲性胶束中，与乳酸氧化酶（PLH1100）形成纳米组装体。PLH1100在980 nm处具有光谱吸收，光热转换效率为58.7%，具有NIR-II肿瘤成像能力。除了光热消融肿瘤外，PLH1100还能调节乳酸代谢，激活免疫原性细胞死亡，改善肿瘤微环境，促进T细胞浸润活化。进一步研究表明，PLH1100能有效杀伤人和鼠GBM细胞，抑制BALB/c-nu小鼠原位U87肿瘤生长，增强fn14靶向BiTE对C57BL/6小鼠原位GL261肿瘤的治疗效果，达到“1+1>2”的协同治疗效果。
合成和光物理性质研究
我们设计了三种Hcy分子的变体，以1-乙基苯（c,d）碘的平面部分为电子受体，以甲氧基、N、二乙基和1,4-二乙基-十氢喹啉为电子给体，以双键为桥。我们观察到1,14二乙基-十氢喹啉基团促进了吸收和发射光谱的红移。值得注意的是，它的最大吸收波长超过1000 nm，最强发射波长在1100 nm（命名为NIR-II Hcy1100）。而甲氧基取代分子和N，N-二乙基取代分子的最佳发射波长分别为800 nm（近红外Hcy800）和970 nm（近红外Hcy970）。然而，两种分子都表现出较窄的吸收光谱，在900 nm处的荧光吸收可以忽略不计。综上所述，与甲氧基和N，N-二乙基取代相比，1,4二乙基-十氢喹啉取代的Hcy具有优异的光物理性能，是一种适合于GBM PTI的有机光敏剂。因此选择NIR-II Hcy1100与Fn14×CD3 BiTE联合治疗。
PLH1100的制备与表征
基于其高效的递送和脑靶向能力，DSPE-PEG2000Ang-2被认为是一种有前景的靶向治疗GBM的纳米平台。本研究采用DSPE-PEG2000-Ang-2包封NIR-II Hcy1100，然后静电负载LOX构建PLH1100纳米颗粒。通过最大吸收峰从730 nm到800 nm的红移和一个≈1150 nm的荧光发射峰证实了自组装过程。此外，通过透射电镜（TEM）和动态光散射（DLS）测定了纳米复合材料的粒径，发现纳米复合材料形成了平均直径为206 nm的均匀球体。此外，LOX的存在或不存在（指定为PH1100）影响了纳米颗粒的zeta电位，其平均电位分别为- 40.2 - - 31.0 mV，而游离LOX的电位为≈12.0 mV，表明LOX与纳米颗粒成功结合。采用紫外-可见分光光度法测定NIR-II Hcy1100和LOX的浓度。结果表明，PLH1100中NIR-II Hcy1100的浓度为404.5 μ mL−1，LOX的浓度为375.8 μ mL−1。在980 nm激光照射下，记录了plh110的体外光热效应。用980 nm激光在0.5 W cm−2下照射10分钟，导致不同浓度PLH1100的PBS快速升温。此外，我们还记录了10 μg mL−1 plh110在不同激光强度下10 min的温度变化。结果表明，光热效应与PLH1100浓度和激光照射强度呈正相关。在980 nm激光（0.5 W cm−2）下，plh110水溶液（15 μg mL−1）的光热加热和冷却曲线如图所示。冷却时间与ln（温度）的线性拟合如图所示，从中我们计算出PLH1100的PCE为58.7%。在浓度为15 μg mL−1时，评估了plh100光热效应的稳定性。经过多次激光辐照后，其峰值温度保持在≈66°C，性能没有明显下降，显示出良好的光热稳定性。
PLH1100体外诱导免疫原性细胞死亡的研究
plh100处理GL261和U87细胞在980 nm激光照射6 h下HMGB1有明显释放，且光照组细胞外荧光强度远高于对照组和黑暗组。同样，光处理后CRT的表达和ATP的释放也明显增加。PLH1100的光热效应，以及LA的消耗，不仅可以有效地杀死肿瘤细胞，还可以刺激显著的ICD。我们构建了Fn14×hCD3 BiTE（简称hBiTE），可以介导人T细胞靶向U87细胞系。为了进一步评估PTI通过激活ICD联合BiTE的协同抗肿瘤效果，我们还表达了一个Fn14×CD3 mBiTE（简称mBiTE），它能够介导小鼠T细胞杀死GL261-hFn14/luc（一种表达人Fn14蛋白和荧光素酶的小鼠GBM细胞系）。我们的结果表明，mBiTE的分子量在55-70 kDa之间，与hBiTE相似，表明mBiTE已经成功构建和纯化。在免疫介导杀伤评价中，mBiTE （0.1 μ mL−1）表现出优异的杀伤效果，在效应细胞与靶细胞比为8:1、杀伤时间为4 h的情况下，平均杀伤率为55%。在不同浓度梯度下的后续评价显示，mBiTE的EC50为0.064 μ mL−1。在相似的条件下，还评估了协同治疗策略。我们评估了PLH1100的PTI对GL261-hFn14/luc的杀伤作用。激光照射后，光热效应改变了肿瘤细胞的形态，导致部分细胞死亡。然后，检测激光照射后4、8、12 h分别添加mBiTE或/和小鼠T细胞（mT细胞）的杀伤效果，结果表明，仅添加mBiTE或mT细胞对GL261-hFn14/luc的杀伤效果没有显著提高。激光照射后同时加入mBiTE和mT细胞的杀伤效果显著，强于只加入mBiTE或mT细胞的处理组。此外，在人体免疫细胞细胞毒性实验中也观察到这种协同治疗作用，激光照射后同时添加hBiTE和hT细胞对U87细胞的杀伤作用比其他四组更明显。最后，考虑到光热效应和mbit介导的mT细胞活性都伴随着DAMPs和炎症因子的释放，有助于淋巴细胞的增殖。因此，我们使用CytoTell Red来监测mT细胞的增殖。共培养杀伤24 h后，协同处理组mT细胞信号强度下降34.2%，高于非协同处理组（分别为24.7%和10.5%）。这进一步表明，协同作用下的mT细胞更活跃，进行了更多的增殖分裂。同样，联合处理下的hT细胞信号强度较其他组明显降低。
PLH1100在BALB/c-nu小鼠原位U87模型中的生物分布成像及PTI治疗效果评价
我们首先使用transwell模型评估其在体外穿过血脑屏障的能力。在U87和GL261-hFn14/luc下腔细胞中检测到的红色荧光表明，经Ang2修饰的PLH1100可以有效穿透血脑屏障，而未经修饰的PLH1100穿透能力非常有限。随后，我们评估了PLH1100在不同时间点携带原位U87肿瘤的BALB/c-nu小鼠中的动态分布。结果显示，plh100在给药3 h后在颅内肿瘤中积累，在12 h时荧光强度达到峰值，随后逐渐降低。在监测期间，肝脏被确定为plh100积累的主要器官，在给药后9小时荧光强度最高，其次是肺和肾脏。NIR-II荧光成像具有优异的深层组织穿透性、低背景噪声和高分辨率的特点。考虑到NIR-II Hcy1100的发射光谱超过1100nm，我们采用NIR-II成像来评估PLH1100在颅内肿瘤内的动态分布。如图所示，与cy5.5标记的纳米颗粒的成像特征一致。给药后3 h可见肿瘤成像，12 h荧光强度达到峰值。然后，体内光热效应测量显示，在980 nm激光照射（0.5 W cm−2）下，治疗组颅内温度随时间逐渐升高，6 min内达到55℃，满足轻度光热治疗的要求，而对照组无明显温升。我们使用BALB/c-nu小鼠原位U87肿瘤来评估PLH1100的治疗效果及其对ICD的激活作用。建立原位U87模型7天后，每只小鼠接受单剂量plh100 (10 mg kg−1)，12 h后进行980 nm激光治疗。每次激光照射6 min，重复4次。MRI监测肿瘤生长情况。随着时间的推移，对照组、PBS+Light组和PLH1100+Dark组的肿瘤体积比PLH1100+Light处理组增大更多。第21、28天，plh100 +Light组的平均肿瘤体积显著小于其他3组（p < 0.01）。相应的，与其他三组相比，PLH1100+Light处理组的小鼠存活时间更长。进一步的组织病理学分析显示，plh100 +光处理组ki67阳性率较低，tunel阳性率较高，肿瘤凋亡明显，说明光热作用在一定程度上减缓了肿瘤增殖，诱导肿瘤死亡。重要的是，我们还评估了诱导的DAMPs，如HMGB1和CRT。PLH1100+Light处理显著促进核HMGB1的释放和细胞外CRT的表达，有助于激活抗原提呈细胞，增强机体的肿瘤免疫应答。
总结
本研究采用供体取代工程的方法，开发了3种具有D-π-A结构的hhy基分子，最终选择了光谱性能最好的分子来构建PLH1100纳米颗粒。plh100作为纳米组合体具有脑靶向性、肿瘤富集性、光稳定性和生物相容性等优越性能，具有优异的光热转换效率和NIR-II肿瘤成像，非常适合用于脑GBM的PTI治疗。plh100还表现出对LA代谢和ICD激活的优越调节，从而改善GBM的酸性和免疫抑制特性，并激活TME。令人兴奋的是，plh100显著增强了fn14靶向BiTE药物的疗效，实现了大于各部分之和的协同效应。
参考文献
https://doi.org/10.1002/adfm.202413847
分子诊断试剂一站式解决方案
分子探针之声团队面对客户的个性化需求提供（半）花菁，二氢吡咯氟硼，酞菁/卟啉，苯并噻二唑，罗丹明，荧光素，四苯乙烯，克酮酸，萘酰亚胺，等可见/近红外（二区）荧光/光声，AIE，药物释放等荧光探针，并提供荧光染料溶液性质研究和细胞/活体的成像和治疗相关课题设计与外包服务。如有任何需要，请联系陈老师(微信号:18506228039)或关注卓欣雅科技公众号。
分子探针之声建立了“分子探针科研交流群”，可以添加小编好友(微信号:18506228039，请备注：姓名-单位-研究方向)，邀请入群。
若您自制的材料可以入驻Xprobe平台，添加小编为好友(微信号:18506228039，请备注：入驻Xprobe)。
