内容提要
我们报告了在第二个近红外窗口（1,000-1,700 nm, NIR-II）具有尾部发射的大小和形状分辨的荧光DNA框架（FDF）点，这使得在肿瘤小鼠模型中实现了接近单细胞水平的肿瘤靶向深层组织（~1 cm） NIR-II成像。构建嵌入疏水纳米腔的DNA框架，使设计的NIR-Ib （900-1,000 nm）探针（染料Sq964）被非共价包封。FDF点具有较高的水溶性、亮度和光稳定性。我们发现具有增强信号强度的FDF点的稳定肿瘤保留源于它们在肿瘤细胞中的形状依赖性积累。基于fdf点的肿瘤成像显示，体内灵敏度低至约40个肿瘤细胞，肿瘤与正常组织的高比率高达约26，长期成像超过11天。我们还展示了NIR-II图像引导下的乳腺癌手术，可以完全切除最小尺寸为~53 μm（~20个细胞）的转移灶。
NIR-Ib FDF点的设计、合成与表征
具有电子供体-受体-供体（D - a - D）方酸结构的NIR-Ib染料（命名为Sq964），该结构由方酸作为受体(a)和1,8-萘内酯衍生物作为供体(D)构成。我们预计具有纳米大小的疏水腔的DNA框架可以通过疏水相互作用封装Sq964分子。我们首先制备了三种不同大小和形状的DNA框架，包括小尺寸四面体（边长20 bp， ~6.7 nm）、立方体（边长20 bp， ~6.7 nm）和大尺寸四面体（边长37 bp， ~12.3 nm）。这些DNA框架通过单链DNA的热退火组装。产物的原子力显微镜（AFM）图像显示，线框纳米颗粒分散在衬底上，表观尺寸为~8.5±1.4 nm, 8.8±1.4 nm和12.4±1.7 nm，分别对应于小四面体，立方体和大四面体，证实了DNA框架的形成具有规定的尺寸和形状。
在构建DNA框架后，我们询问了它们的结构稳定性和细胞摄取效率，这是细胞标记的前提。我们发现，在测试的DNA框架中，小四面体在含血清（10% v/v）的细胞培养基中表现出最佳的结构稳定性，在体外培养的小鼠乳腺癌细胞中表现出最高的细胞荧光强度（4T1）。DNA框架主要通过能量依赖的主动内化途径进入细胞。我们选择小的四面体DNA框架来制备FDF点，除非另有说明。合成了NIR-Ib分子染料Sq964，并对其光学性质进行了表征。该产物在典型的有机溶剂中表现出明显的近红外激发和明亮的NIR- ib发射（在二甲基亚砜（DMSO）中在~964 nm处达到峰值），使用IR 26作为参考染料测量到的荧光量子产率为~0.035%，在1,2-二氯乙烷中测量到的荧光量子产率为0.050%。特别是，相对于传统的D-A-D染料（通常<900 nm）15，Sq964单体在DMSO中呈现出更深的近红外吸收峰（~915 nm），这可归因于扩大的π共轭体系。游离的Sq964表现出较差的水溶性，这可能导致在水环境中聚集导致猝灭。随着DMSO溶液中水分数的增加，我们观察到其在915 nm处的吸收峰强度降低，荧光强度降低。同时，在~700 nm处出现另一个吸收峰，表明强π-π相互作用导致H聚集体的形成。在含血清的细胞培养基中，Sq964的荧光强度部分恢复，但仅为DMSO中观察到的~9.25%。而且，即使在DMSO中，连续808 nm激光（500 mW cm-2）照射120分钟后，荧光强度也下降了~22.2%。因此，游离Sq964的水溶性和光稳定性差阻碍了其在生物成像中的直接应用。
我们将染料分子和小四面体DNA框架以100:1的摩尔比混合在水溶液中，将它们整合到FDF点中。在AFM下得到的结构呈现出与空DNA框架相似的形态（平均表观尺寸，~8.8 nm）和分散性，这表明DNA框架的结构没有被疏水染料破坏。在凝胶电泳图中，Sq964的NIR-II荧光与DNA框架带共定位（用DNA嵌入染料GelRed染色）；然而，双链DNA或无烷基DNA框架和自由的Sq964（单独或混合）在水环境中没有明显的近红外吸收和近红外发射带，这表明Sq964和DNA框架的结合确实依赖于封装而不是DNA插层，非特异性吸附或聚集。通过定量凝胶能带强度，我们估计FDF点的产率为~75%。随后，通过超滤去除未封装的染料。
我们表征了FDF点在水环境中的光学性质。我们观察到FDF点的吸收峰为~960 nm，比DMSO中的自由Sq964的吸收峰深得多。同时，相对于DMSO中游离的Sq964， NIR-Ib荧光发射波长几乎没有变化（峰值在~965 nm），这表明Sq964的荧光特性在DNA框架内基本保持不变。我们估计，每个DNA框架，平均封装三个Sq964分子。我们还发现，FDF点的近红外荧光亮度随着其在TM缓冲液中浓度的增加而单调增加。在200 μM范围内未检测到淬火。ICG在相同溶液中浓度达到4 μM时发生猝灭。这些结果共同表明，具有规定形状和大小的DNA框架可以提供接近定量的染料封装能力，导致染料在水溶液中的良好分散，从而产生明亮的NIR-Ib荧光。接下来，我们在体外评估了NIR-Ib荧光在FDF点上的穿透性。我们发现，从FDF点发射的NIR-Ib可以穿透脂肪内组织幻象，深度可达1cm，比临床批准的吲哚菁绿（ICG）在TM缓冲液(~ 3mm)/含血清介质（~ 5mm）中的深度深~3.3 /2倍。当放置在相同的3 mm/5 mm深度时，FDF点的SBR比为~50.2/29.6，比ICG高~8.8/7.0倍（在TM缓冲液/含血清培养基中为~5.7/4.2）。
我们还评估了FDF点（2 μM）在TM缓冲液、0.5×磷酸盐缓冲盐水（PBS）和含血清细胞培养基中37°C的光稳定性。我们发现，在所有测试溶液中，FDF点在808 nm激光照射（500 mW cm-2）下暴露2小时后，其荧光强度几乎与初始状态相同。因此，在这些水环境中，在相同浓度下，FDF点的光稳定性优于ICG。我们评估了FDF点在酸性环境（pH 5.0）中的稳定性，近似于细胞内内体/溶酶体条件。在37°C下放置24小时，通过AFM观察到的大多数FDF点保持完整。它们的凝胶迁移模式基本不变其光吸收强度仅下降~6.5%。FDF点的结构和功能在酸性环境中至少可以保持24小时的稳定。为了证明这个平台的普遍性，我们试图用DNA框架封装另外十种疏水染料。这些包括P2、IBDOH-NO、BDOH-NO、2-COOH SiR650、TTQ-TF、TTQ-F、TPA-BTDH、Aza-BDPE、IR1048和IR1061。我们的凝胶电泳分析显示，除了IR1048和IR1061外，其余八种染料或多或少被封装在四面体DNA框架内。
用FDF点标记乳腺癌细胞
我们研究了不同大小和形状的FDF点的细胞标记能力。凝胶电泳分析显示，Sq964在一定程度上被封装在这些DNA框架内。我们用这三种FDF点孵育4T1细胞，在NIR-II显微镜下观察到，小的四面体FDF点导致细胞荧光强度最高。荧光强度与fdf点浓度和孵育时间呈正相关。在我们的条件下，与小四面体FDF点（200 nM）孵育12小时，导致细胞NIR-II荧光水平稳定，几乎~100%的细胞（用橙色细胞跟踪器染色）为NIR-II阳性，表明标记效率高。因此，除非另有说明，我们在接下来的实验中使用了这种标记条件。值得注意的是，即使经过10天的孵育期，包括标记细胞的5次传代，细胞仍保持高水平的荧光。这一观察结果表明，FDF点可以从亲代细胞转移到它们的后代，从而有可能长期跟踪肿瘤细胞的发育。我们还发现NIR-II点的共定位和LysoTracker（一种用于跟踪内体/溶酶体的荧光染料）的荧光在孵育的前2小时迅速增加，并在2小时达到约90%，这表明FDF点在内化后主要位于内体/溶酶体中，这与之前报道的DNA纳米结构的细胞摄取途径一致。孵育24 h后从细胞中收集到的FDF点，其吸收光谱和NIR- ii发射光谱相对于新鲜的峰位几乎没有变化，这可能有助于NIR荧光在肿瘤细胞中的积累和长期保留。这些结果表明FDF点在活细胞内体/溶酶体中具有稳定的功能。我们还评估了FDF点的细胞毒性。经过12天的细胞培养，fdf点标记细胞的生长速度与未标记细胞相比差异不大。细胞内过氧化物/超氧化物和乳酸脱氢酶（LDH）水平没有明显升高。给小鼠注射FDF点并没有引起白细胞介素-6或肿瘤坏死因子-α水平的明显升高。这些结果表明，FDF点的细胞毒性和免疫毒性最小，与先前对DNA框架的几项研究一致。
乳腺癌细胞的高灵敏度体内成像
我们对小鼠乳腺癌细胞进行了体内NIR-II成像。在裸鼠右侧第二乳腺脂肪垫注射不同数量（~40 ~ 1400个）的fdf点标记的乳腺癌细胞，然后在808 nm激光照射下成像。我们观察到，在小鼠注射部位周围出现了NIR-II荧光斑点，其综合强度与注射细胞数呈正相关。在注射细胞达到170个时，肿瘤与正常组织（T/N）荧光比超过13，表明该系统在体内具有较高的SBR比率。值得注意的是，在体内只有约40个标记细胞可以导致可见的NIR-II斑点。这种接近单细胞的灵敏度优于先前报道的ICG（在NIR-I区域）的结果，这可归因于生理环境中超高的NIR-II亮度。我们进一步研究了FDF点在体内长期监测肿瘤进展的能力。注射fdf点标记细胞的小鼠从第3天到第11天进行体内NIR-II成像。我们注意到来自植入肿瘤细胞的NIR-II信号持续超过11天，T/N比没有明显衰减。我们还观察到NIR-II斑点随着时间的推移逐渐扩大(第3-11天。切除不同天数的NIR-II阳性组织，通过苏木精和伊红染色评估，证实NIR-II斑点大小随肿瘤生长而扩大。因此，FDF点有望监测肿瘤进展。
总结
我们开发了FDF点作为一类新的NIR-Ib探针，具有近单细胞灵敏度，厘米穿透性和高稳定性。在活体小鼠中，我们利用FDF点原位跟踪来自约40个细胞的肿瘤，并进行长期（11天）肿瘤监测。我们展示了NIR-II图像引导手术切除乳腺癌转移瘤（小至53 μm大小或约20个细胞）。该系统具有几个优点。首先，DNA框架为各种有机荧光染料的非共价包封提供了一个精确和通用的平台。这将染料分子与周围的水环境隔离开来，确保了它们的分散性，并将环境干扰降到最低。其次，DNA框架具有可编程的大小、形状和表面化学，有助于调节细胞内化性能。此外，考虑到DNA框架的能力，FDF点的功能可以进一步扩展，以空间组织的方式整合各种功能模块。
参考文献
https://doi.org/10.1038/s41566-024-01543-7
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