内容提要
我们利用探针共轭结构破坏策略构建了具有“零”探针固有荧光特性的氢化磷取代罗丹明（H−PRh）。在此基础上，筛选了一系列天然产物，用于抗氧化候选药物的鉴定。木犀草素通过激活Sirt1-Nrf2-HO-1信号通路调控ONOO−在肝肾综合征中的积累而被筛选出来。总的来说，这里构建的“零”探针固有荧光ONOO -传感器适用于一个有前途的多功能工具箱，用于阐明肝肾综合征中ONOO -相关的病理过程。
合成与表征
我们的目标是开发一种具有“零”探针固有荧光特性的ONOO -响应传感器。更重要的是，根据Yamaguchi组和Stains组之前的工作，制备了罗丹明类似物的C-9位还原形式，并进行了进一步的氧化反应，得到了荧光染料。通过C-9位还原形式的氧化反应制备罗丹明的这些细节对我们来说是一个很好的提醒。此外，基于我们之前的工作，罗丹明，Si -取代罗丹明（SiRh）和磷-取代罗丹明（PRh）这类新兴的荧光染料由于其明显的优点，包括强烈的近红外发射，理想的生物相容性和灵活的修饰，显示出巨大的潜力作为骨架。因此，我们利用Rh、SiRh和PRh作为荧光骨架，合成了非共轭化合物作为ONOO−响应候选传感器。
光物理性质
有了这三个探针，首先研究了ONOO -响应能力的潜力。探针H−Rh对各种活性氧具有很高的选择性（增强18倍），但相对较短的发射波长（580 nm）限制了在体内的进一步应用。对于H−SiRh，其发射波长较长（680 nm），但对ONOO−的选择性较低（3倍增强），也不符合要求。令我们高兴的是，在三个探针中，H - PRh具有长发射波长和高选择性的特点。因此，它被筛选为有前途的ONOO -响应候选传感器。随后，在生理条件下对更多的光物理特性进行了初步评价。首先，测试了吸收光谱。如图所示，PRh在712 nm处显示主吸收峰，H - PRh在354 nm和394 nm处显示两个不同的吸收峰，这两个吸收峰可以归属于氧化三苯基膦衍生物部分的特征吸收峰。随后，研究了PRh的荧光光谱。如图所示，随着溶剂极性的增加，荧光光谱显示出明显的色移特征，这可以用已知的罗丹明衍生物中常见的ICT效应来解释。PBS和MeCN中PRh的荧光量子产率分别为13.10%和30.73%。对H−PRh的过氧亚硝酸盐传感特性进行了测试，如图所示。354和394 nm处吸光度逐渐降低。在测试缓冲液中加入过氧亚硝酸盐后，在712 nm处出现了一个明显的新吸收峰，这可能是荧光化合物PRh的形成。此外，根据吸收光谱结果，得到了ONOO -的浓度与712 nm处吸光度的曲线。在0 ~ 40 μM的ONOO−范围内，二者呈良好的线性关系，显示了ONOO−肉眼检测的潜力。随后进行荧光响应实验。H - PRh是非荧光的，在37°C下暴露于ONOO -后，在733 nm处可以观察到明显的荧光强度增强。吸收光谱和荧光光谱与荧光染料PRh相匹配。ONOO−与还原型荧光染料H−PRh发生了有效反应，形成了荧光强的π共轭结构。滴定结果表明，ONOO−(0 ~ 40 μM)浓度与荧光强度呈良好的线性关系。根据滴定曲线计算出的检测限为18.9 nM，对ONOO−具有理想的灵敏度。此外，作为一种理想的荧光探针，良好的响应选择性是关键。为此，我们进行了H2O2、ClO−、•OH、O2•−、thbhp等其他活性氧物种，谷胱甘肽（GSH）、半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）、H2S等高活性生物物种，阳离子（Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+）等电位物质的选择性响应实验。如图所示，只有ONOO−可以引起显著的荧光增强，而潜在的干扰物质的增强可以忽略不计。此外，还研究了pH对H - PRh的影响。如图所示，从pH 3.0到pH 9.0的缓冲液，荧光强度变化明显。并对H - PRh的响应动态进行了测试。加入ONOO−后，荧光强度迅速增强，显示出H−PRh的超快响应能力。
活细胞中ONOO−动态变化的生物成像
采用标准CCK-8法检测探针和荧光染料的细胞毒性。如图S8所示，在3.125−12.5 μM H−PRh条件下预处理24 H， HepG2细胞基本能存活，说明该探针具有良好的生物相容性。随后，利用H - PRh检测活细胞中的ONOO−。首先，研究H - PRh的细胞成像浓度。如图所示，随着H−PRh浓度的增加，可以观察到细胞内荧光强度逐渐增强。当浓度为10 μM时，已能较好地实现清晰、高信号-背景的活细胞荧光成像。研究了包括癌细胞和正常细胞在内的一系列细胞类型（HL-7702、PC-12、HeLa、HepG2和4T-1）。如图所示，探针在不同细胞系中显示出不同的荧光强度，这代表了内源性ONOO−水平的差异。然后进行共定位染色实验。在红色荧光通道中观察到线粒体清晰的形态特征。皮尔逊系数为0.90。这表明在ONOO -激活后，探针主要定位于线粒体区域，而ONOO -似乎主要产生于线粒体区域。结果与以往有关磷罗丹明的相关报道相吻合为了验证在广泛的生物领域检测内源性ONOO−的能力，我们利用raw264.7巨噬细胞刺激ONOO−的产生。
得益于令人印象深刻的活细胞成像结果，探针H - PRh显示出作为高通量筛选抗氧化剂的可视化筛选工具的巨大潜力。因此，我们开始使用H - PRh建立一个有效且简单的高通量筛选平台。简单地说，用100 μM具有潜在抗氧化活性的天然产物处理HepG2细胞12小时，减少ONOO−的形成，然后在成像前用探针h - PRh对HepG2细胞染色60分钟。在共聚焦激光扫描显微镜和Tecan-Spark微孔板阅读器上记录荧光图像并进行定量分析。通过简洁的方法，可以很容易地检测到内源性ONOO−的产生。在本节中，对23种具有不同类型化学结构的天然产物（如多酚类、醌类、生物碱和倍半萜）进行了评价。让我们高兴的是，高通量筛选结果显示，只有两种天然产物（木犀草素和槲皮素）能够显著降低荧光强度，这代表了内源性ONOO−的下调。
总结
我们的目标是通过解决当前ONOO -反应荧光探针的挑战，开发一种高通量筛选方法，以增强对肝肾综合征发展过程的机制的理解。所设计的共轭结构破坏了具有非荧光特性的化合物H−PRh。由于这一优势，它显示出高灵敏度和超快的传感效率，成功地监测了细胞中的ONOO−波动。更重要的是，基于该探针，筛选了一系列具有潜在抗氧化效率的天然产物。通过H - PRh的荧光强度可以直观地评价其抗氧化效果。木犀草素是金银花中草药中的一种活性提取物，可使HepG2细胞的荧光强度降低一半以上，显示出良好的减少ONOO−积累的能力。此外，在肝肾综合征小鼠模型中，探针可以很好地检测损伤肝脏和肾脏中的ONOO−，完成肝肾综合征小鼠的诊断。筛选的化合物木犀草素也用于体内还原ONOO−。荧光图像显示木犀草素在体内也具有抗氧化能力。最后，对木犀草素抗氧化作用的机理进行了进一步的研究。Western blot结果显示，木犀草素激活Sirt1/Nrf2/ ho -1信号通路，调控ONOO−的生成。因此，简而言之，本文开发的破坏H - PRh的探针共轭结构可以作为一个有用的工具箱，为ONOO−波动的高灵敏度动态监测提供了很大的希望。
参考文献
https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.4c01858
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