内容提要
明亮的近红外（NIR）荧光探针在体内光学成像中发挥着重要作用。在这里，由Aza-BODIPY制备的可清除肾脏的纳米点被报道为多光子脑成像的荧光团。给体-受体-给体（D-A-D）型共轭结构的设计使荧光团在1620 nm和2200 nm激发下都具有较大的三光子吸收截面。侧链修饰和脂质包封在水相中产生超小纳米点（≈4 nm）和高荧光量子产率（≈0.35），在720 nm发射。纳米点中单个Aza-BODIPY荧光团的三光子作用截面比常用的磺胺101染料高约30倍。在活体小鼠研究中，展示了皮层下结构的三光子脑深部成像，达到脑表面以下1900 μm的深度。利用线扫描三光子显微镜（3PM），纳米点可以测量1617 μm深度的血流。这项工作为多光子脑深部成像提供了优越的荧光探针。
分子设计与合成
我们选择吡咯[吡咯基]氮杂吡啶（PPAB）作为受体是因为PPAB衍生物在有机相中具有大的吸收系数和高的荧光量子产率。我们将受体与具有不同给电子能力的给体偶联，合成了三种具有D-A-D结构的荧光分子（FPB、TPB和PPB）。此外，我们通过点击反应将PEG侧链接枝到分子中，提高了这些分子的水溶性。所有的合成过程和表征都在支持信息中描述。FPB、TPB和PPB在甲苯中的吸收峰分别为680、681和690 nm。吸收峰与理论计算的能带隙一致此外，FPB、TPB和PPB在吸收最大值处的摩尔消光系数分别为1.1 × 105、9.3 × 104和2.9 × 104 m−1cm−1。吸收测试表明，FPB和TPB的吸收系数比PPB分子高3倍以上。三种荧光团在甲苯中的FPB、TPB和PPB分别表现出702、706和694 nm的近红外发射峰。荧光团的吸收和发射都位于约700 nm，表明它们适合在1600-2200 nm的成像窗口内进行三光子激发。
多光子纳米点的制备与表征
我们尝试用脂质包封的方法将FPBP、TPBP和PPBP制成明亮的纳米点。每个荧光团和peg -共轭磷脂（DSPE-PEG, Mw 2000）以不同的重量比溶解在THF溶液中，然后与不完全超声混合。我们利用动态光散射和荧光光谱对所得纳米探针进行了表征。如图所示，这些纳米颗粒的平均水动力直径强烈依赖于荧光团与DSPE-PEG的重量比，当荧光团的比例从50%减少到5%时，平均水动力直径从20 nm到4 nm不等。透射电子显微镜（TEM）图像进一步证实了封装纳米点的尺寸变化。图中显示了脂质封装的FPBP纳米点和FPBP分子在THF溶液中的吸收和发射光谱。与有机相的FPBP分子相比，水中的纳米点仅显示出轻微的光谱位移，这表明脂质封装使FPBP荧光团在纳米点中聚集最少。通过监测连续照明下的荧光强度来检测光稳定性。光照射1200 s后，FPBP纳米点的荧光强度仍接近于原始强度，而罗丹明B染料的荧光强度仅为原始强度的40%。这一比较清楚地表明FPBP纳米点具有优越的光稳定性。在NIR-II窗口激发下，利用三光子成像系统进一步研究了FPBP纳米点的非线性光学特性。如图2d所示，荧光信号与激发功率的关系表明，FPBP纳米点在激发波长1600、1700、1800、2200 nm处的拟合斜率分别为2.82、2.95、3.13、3.18。结果表明，FPBP纳米点具有三光子荧光特性。FPBP纳米点波长相关的三光子作用截面，通过我们自制的系统测量，以磺胺101 （SR101）作为参考染料（详细信息为辅助信息）。在1620 nm处测得单个FPBP荧光团的值为40.36 × 10−82 cm6(s/photon)2, 2200 nm处测得的值为1.65 × 10−82 cm6(s/photon)2。单个FPBP荧光团在1620 nm处的值比市售的SR101染料高约30倍。此外，FPBP纳米点中单个荧光团的值也比先前报道中的多个荧光团大，使其成为脑深部多光子成像的优越探针。
我们使用标准MTT方法评估了FPBP纳米点对人乳腺癌（MCF-7）细胞的细胞毒性。如图所示，不同浓度纳米点（0≈150 μ mL−1）孵育24 h后，细胞存活率均在90%以上，表明纳米点具有良好的生物相容性。为了进行体内毒性研究，我们将FPBP纳米点经尾静脉注射到健康小鼠体内。注射后7 d处死小鼠，检查主要脏器组织切片。与对照小鼠相比，心、肝、脾、肺、肾、脑等各脏器未见明显异常或炎症。除了良好的生物相容性，肾脏清除率是非常理想的荧光探针用于体内成像应用。流体动力学直径小于5.5 nm的纳米颗粒可以通过肾脏过滤从体内清除并随尿液快速排出。研究了FPBP纳米点在尾空注射小鼠体内的药动学和生物分布。利用小动物成像系统采集不同时间间隔仰卧位的荧光图像。注射纳米点后，膀胱明显观察到荧光信号，而全身荧光信号随时间迅速下降。手术打开腹部皮肤后，纳米点注射30 min后，肾脏和膀胱均检测到强荧光信号，这是肾脏清除的典型现象。24小时后，两个器官的荧光消失。从这些图像中可以明显看出，超小的FPBP纳米点实际上是清晰的。图中显示了小鼠体内选定区域的荧光强度随时间的变化，表明纳米点在24小时内被快速清除。随后，通过收集不同器官（包括心、肝、脾、肺和肾）的荧光信号来评估纳米点的生物分布。如图所示，纳米点在注射后2 h主要分布在肺、肝和肾脏，24 h后这些器官的荧光信号明显减弱。所有动物体内实验均为3只小鼠。上述结果表明，由于纳米点的超小尺寸，它们可以通过泌尿系统迅速排出体外。
小鼠脑血管的体内三光子成像
我们利用自制的1620 nm飞秒激光源和MPM系统探索了小鼠大脑的体内三光子成像。实验设置和动物程序在辅助信息中描述。如图所示，在重建的三维图像叠加中，可以清晰地分辨出脑表面以下1900 μm深度的血管。同时获得的三次谐波成像描绘了脑表面下870 ~ 1100 μm白质层的位置。解剖上，白质层的上方和下方分别是新皮层和海马体。因此，我们的三光子成像能很好地穿透海马层，显示海马内的血管系统。此外，在最大成像深度为脑表面以下500 μm处，通过完整颅骨对小鼠脑深部结构进行了体内三光子成像。信号与背景比（SBR）是评估成像质量的关键参数，3PM与2PM相比的巨大优势在于对深部组织的SBR有所改善。因此，我们通过绘制不同成像深度下血管的线条轮廓来测量SBR，以量化峰值与背景荧光之间的比率。图4h-j分别为850、1500和1900 μm深度下的三光子图像。这代表了有机荧光探针在体内最深的3PM。图4k-m显示了这些图像中沿白色虚线的SBR，分别为202:1、150:1和11:1。此外，我们还测量了通过完整颅骨的三光子图像的SBR，在最大深度为500 μm时，SBR仍然是3:1。成像深度和SBR结果表明，PFBP纳米点具有优异的三光子成像性能。脑血管血流动力学研究对脑血管疾病的诊断和治疗至关重要。考虑到优越的三光子成像性能，我们尝试使用3PM线扫描测量不同深度的脑血管血流速度。我们测量了位于1105、1518和1617 μm深度的血管在白质层和海马中的速度。沿着血管中心的白色虚线对图像进行线扫描，可以看到一条清晰的条纹，其斜率为血流速度。血管在1105、1518和1617 μm处测得的流速分别为0.61、0.52和0.91 mm s−1。虽然我们获得了1900 μm深度的二维血管图像，但由于荧光信号较弱，我们无法从1617 μm以下的血流动力学成像中提取出清晰的条纹。
总结
我们开发了基于Aza-BODIPY荧光团的肾脏清除有机探针，用于脑深部三光子成像。荧光团由D-A-D型共轭骨架组成，在有机相中具有大的三光子吸收截面和高的荧光量子产率。通过侧链聚乙二醇修饰和脂质包封提高了荧光团在水溶液中的溶解度，得到了超小纳米点（≈4 nm）和高荧光量子产率（≈0.35）。在1620 nm处测得的单FPBP荧光团的三光子作用截面比市售的SR101染料高30倍。我们展示了活体小鼠脑血管系统的三光子成像。在1620 nm的激发下，可以清晰地分辨出1900 μm深度的去颅小鼠的脑血管结构，也可以清晰地分辨出500 μm深度的完整颅骨小鼠的血管结构。在1620 nm的激发下，纳米点能够测量1617 μm深度开颅小鼠的脑血管血流速度。该研究为体内多光子成像提供了有前途的荧光探针。
参考文献
https://doi.org/10.1002/smll.202403994
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