内容提要
我们开发了芳基酮取代菁氨酸（ACy R），这是第一个用于缺氧癌症治疗的红光触发光引发剂。这些ACy R分子继承了花青素染料的近红外吸收，芳基酮修饰赋予其吸氢能力。实验和量子计算表明，修饰芳基的吸电子基团（如ACy-5F）提高了O原子对光子激发过程的贡献，促进了系统间的交叉和H的提取能力。ACy-5F迅速渗透细胞并在内质网富集。即使在严重缺氧的情况下，ACy-5F启动红光诱导的细胞内生物分子H提取，诱导坏死性下垂和铁下垂。此外，在H提取后，ACy-5F被降解，从而避免了治疗后长期光毒性的副作用。
分子设计、合成与光物理特性
通过Vilsmeier-Haack和Knoevenagel反应成功地在菁氨酸的中间位置引入芳基酮结构，得到了ACy-5F、ACy-AN和acy - 3c，以及未取代的Cy H和醛取代的Cy- cho作为对照。如图所示，Cy H的最大吸收峰（λabs）约为680 nm，而ACy R和Cy- cho的λabs蓝移至630-645 nm。它们的发射光谱也表现出蓝移。一般来说，O原子参与光子激发过程会导致摩尔消光系数和荧光量子产率的降低。因此，观察到ACy-5F的消光系数降低到6.8×104 m1 cm 1，荧光量子产率降低到2.2% （c.f， 17.4%对于Cy5-H）。我们得到了ACy R和Cy-CHO在不同粘度溶剂中的荧光发射光谱。所有染料在乙醇（低粘度）中发出弱荧光，在1,5-戊二醇（高粘度）中发出强荧光。特别是，CyCHO的荧光在1,5-戊二醇中增加了7倍，因为醛的取代增加了激发态的非辐射跃迁。对于ACy R，在1,5-戊二醇中，荧光仅增加了约4倍，因为荧光猝灭不仅是由于非辐射跃迁的增加，而且是由于光子激发过程中的O原子。活性氧（ROS）生成能力是确定染料ISC效率的重要指标。9,10-蒽二基-双（亚甲基）二羧酸（ABDA）被用来评估染料在红光照射下在水介质中产生单线态氧（1O2）的能力。与Cy- cho和Cy- H相比，添加ACy R后ABDA的漂白速度更快，说明芳基酮修饰提高了ISC效率。然而，acyr降解ABDA的能力不如商业光敏剂亚甲基蓝（MB）。这可能是因为三激发的acyr难以与O2进行能量转移。随后，以双氢乙啶（DHE）和羟基苯基荧光素（HPF）作为指标，评估不同染料在水介质中形成氧自由基（O2•-和•OH）的能力。辐照后，在ACy r存在的情况下，DHE和HPF的荧光强度显著增强，特别是对于Cy- 5f， DHE和HPF的荧光强度分别提高了3.2倍和24.9倍，远高于Cy H、CyCHO和MB。实验结果表明，芳基酮修饰增强了菁氨酸的ISC能力，特别是当吸电子基团（如F）被修饰时。
H的消除反应检测
芳基酮化合物可以在最低激发态下从可接近的碳氢键中提取H原子，从而诱导烯烃双键聚合。采用傅里叶变换红外光谱法评价了在苯胺乙酸引发剂的作用下，ACy R对光固化单体三（丙二醇）二丙烯酸酯（TPGDA）中自由基反应的激活能力。在TPGDA的光聚合曲线中，转化率随时间逐渐增加。在630 nm光照射下，在300 s的时间内快速发生了双键聚合。其中，Cy- 5f的双键转化率达到35%，明显高于Cy H的5%。并对聚合速率进行了分析。如图所示，加入ACy R后，双键在前10s内的转化率很快（>2%s 1）。该曲线符合基于吸氢机理的双键聚合的特征。吸H反应通常伴随着光引发剂的光解作用，采用光漂白试验考察了细胞内活性分子在水中作为给H体的能力。试验用N2清除，以避免氧自由基损伤ACy-5F。如图所示，在加入NADH、胸腺嘧啶或亚麻酸后，随着辐照，ACy-5F的吸光度迅速下降，说明它们很容易与ACy-5F形成电子转移配合物的中间体，进行质子转移。相反，丙酮酸、谷胱甘肽和尿嘧啶的加入也导致ACy-5F漂白缓慢，表明H提取效率较低。此外，2,2 ' -氮化二苯-（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸盐）（ABTS）检测烷基自由基，自由基可以被自由基氧化，吸收增强。试验在N2气氛下进行，以消除氧自由基的影响。在辐照后加入丙酮酸、谷胱甘肽、胸腺嘧啶或亚麻酸后，ABTS的吸光度明显增加，表明通过h抽提形成了活性烷基自由基。由于参与h提取后NADH迅速重排为NAD+，这不能导致ABTS吸收的增强。
细胞内烷基自由基鉴定
芳香酮染料的生物相容性较差，阻碍了其生物应用，可通过与具有生物相容性的花青素染料结合来克服这一问题。因此，我们用ACy-5F孵育4T1细胞，用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）记录细胞在不同时间的荧光变化。ACy-5F在30 min内迅速被细胞吸收，4 h后仍能观察到明亮的荧光，证实ACy-5F具有良好的生物相容性。随后，使用商用细胞器选择性跟踪器探测ACy-5F在细胞内的分布。与其他探针相比，ACy-5F的红色荧光与Tracker Green （Pearson’s系数：0.91）和Tracker Blue （Pearson’s系数：0.89）的ER探针有很好的重叠，证实ACy-5F在ER中富集。为了比较ACy-5F在常氧（21% O2）和缺氧（2% O2）条件下产生烷基自由基的能力，我们使用商业探针检测辐照后细胞中的各种自由基。如图所示，在常氧和缺氧细胞中均观察到DCFH-DA （ROS和烷基自由基）、SOSG （1O2）、DHE （O2•-）和HPF （•OH）的荧光，表明ACy-5F可以在细胞中产生烷基自由基和/或ROS。缺氧细胞中DHE、SOSG和HPF的荧光强度明显低于常氧细胞，提示缺氧环境影响了ROS的生成。然而，DCFH-DA的荧光变化很小，因为通过抽h产生的烷基自由基不受缺氧的影响，大量的烷基自由基激活了DCFH-DA。细胞内的烷基自由基可以诱导单体的双键聚合。特别是，已知4-苯乙烯磺酸钠盐（NaSS）的聚合会产生荧光，因此，将非荧光NaSS （50 mM）和ACy-5F （1 μM）添加到4T1细胞中，然后进行照明。胞质中可见绿色荧光，提示胞内产生聚（NaSS）。研究了二茂铁甲基丙烯酸甲酯（FMMA）单体的聚合反应。在4T1细胞中注入FMMA （10 mM）和ACy-5F (1 μM)，然后进行光照。通过透射电镜（TEM）观察4T1细胞内聚合诱导的聚集体。这些结果进一步表明，光诱导ACy-5F形成烷基自由基是成功的。此外，还检测了细胞中谷胱甘肽（GSH）和ATP水平的变化。它们的水平在辐照后显著降低，表明ACy-5F可以被谷胱甘肽和丙酮酸（ATP的重要前体）提取h。用ACy-5F和MB对细胞进行光漂白实验，结果显示，在照射10 min后，ACy-5F的漂白率为97%，而商用光敏剂MB的漂白率仅为45%。ACy-5F的光漂白有效地避免了后处理长期光毒性的缺点。
体内治疗效果
采用脂质体为基础的给药系统来装载ACy-5F。用胆固醇、大豆卵磷脂和DSPE-PEG 2000构建了负载ACy-5F的脂质体纳米颗粒（ACy-5F NPs）。TEM和动态光散射（DLS）显示，ACy-5F NPs具有平均直径约100 nm的球形形貌。ACy-5F NPs包封率为71.9%。ACy-5F NPs具有高光毒性，辐照后成功诱导缺氧4T1细胞坏死和铁下垂。通过静脉注射，在4T1细胞来源的异种移植物模型中初步研究了ACy-5F NPs对肿瘤的靶向作用。荧光信号显示，注射后6小时内，ACy-5F NPs在肿瘤内积累，24小时后仍保持在肿瘤内。体内分布实验也表明，ACy-5F NPs在肝脏和肾脏中代谢。随后，将ACy-5F NPs原位注射到小鼠肿瘤中，观察PDT （630 nm, 80 mWcm2）期间的白化情况。随着辐照时间的延长，ACy-5F的荧光强度逐渐降低。辐照15 min后，荧光强度下降80%。在4T1荷瘤小鼠中评价了ACy-5F NPs的抗肿瘤性能。将小鼠随机分为4组（n=5）：(1) PBS, (2) PBS +光照，(3)单独使用ACy-5F NPs， (4) ACy-5F NPs+光照（80 mWcm-2, 15 min）。通过监测每个腋窝肿瘤的相对体积来评估每种治疗方法对肿瘤的治疗效果。如图所示，(1)-(3)组小鼠肿瘤呈侵袭性生长（11.0倍），而(4)组有效抑制肿瘤生长（1.6倍）。值得注意的是，在治疗期间，四组均未观察到明显的体重减轻。
总结
为了解决光敏剂残留引起的副作用和光动力治疗（PDT）中的缺氧限制，开发了一系列芳基酮取代菁菁染料（ACy R）。在水溶液中，ACy R可以与H给体（如胸腺嘧啶和不饱和脂类）通过红光诱导的H萃取反应产生烷基自由基，而芳基部分的吸电子基团修饰增强了这一反应。量子计算表明，O原子参与光子激发过程减小了单重态和三重态之间的能隙，促进了系统间交叉（ISC）。突出的分子ACy5F迅速渗透细胞，导致缺氧肿瘤细胞DNA损伤和ER吞噬，诱导坏死和铁下垂。此外，ACy-5F在H提取后被降解，从而避免了长期光毒性的副作用
参考文献
doi.org/10.1002/anie.202408769
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