内容提要
二硫化氢（H2S2）在氧化还原生物学和信号转导中起着重要作用；因此，生物深层组织中H2S2的定量可视化对于直接获得相关病理生理过程的可靠信息至关重要。我们首次报道了一个独特的H2S2介导的二硫醚生成反应。基于这一反应，我们构建了第一个NIR-II荧光（FL）和光声（PA）双比例探针（NIR-II-H2S2），用于体内H2S2的定量可视化。该探针具有双比例NIR-II荧光（I840/I1000, 107倍）和光声（PA800/PA900, 6.5倍）对Na2S2物质的响应，具有高特异性，优异的灵敏度（1.8 nM），改善的水溶性和深层组织穿透性。更重要的是，通过NIR-II双比例FL/PA成像，我们成功地证明了该探针可以准确地量化脂多糖或二甲双胍药物诱导的肝损伤小鼠模型中H2S2水平的波动。
FL/PA双比例探针NIR-II- H2S2的合成与光物理性质
我们开发了一类新的H2S2介导的二硫生成反应。在我们的设计中，1,3-二氯部分可以通过简单的化学反应与H2S2特异性反应形成五元杂环。基于这一反应，我们随后扩展了共轭链，将探针分子的吸收和发射波长移至NIR-II区，从而为生物应用提供了良好的基础。我们通过引入磺酸基团修饰探针分子的侧链，以提高其水溶性和生物相容性。我们开发了第一个NIR-II FL/PA双比例探针NIR-IIH2S2，用于体内H2S2的定量可视化。NIR-II- H2S2和NIR-II- H2S2- et的吸收和发射峰均跨越NIR-II区。此外，NIR-II-H2S2在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中表现出100 nm的大Stokes位移，表明NIR-II-H2S2不受自吸收干扰，可以为生物应用提供准确的信号。探针NIR-II-H2S2在PBS、生理盐水和DMEM中进行了细致的稳定性评估。利用紫外-可见吸收光谱、荧光光谱和PA光谱研究了NIR-II-H2S2对H2S2的双倍率NIR-II FL/PA响应。NIR-II-H2S2在PBS/EtOH （7/3, v/v）中的紫外-可见吸收如图所示。随着H2S2浓度的增加（这里Na2S2作为H2S2的供体），以900 nm为中心的吸收峰减小，而在800 nm处出现新的吸收信号。值得注意的是，在图中观察到很强的线性相关性，这表明NIR-II-H2S2可以作为H2S2的比色探针。此外，对不同浓度H2S2的荧光滴定光谱进行了测量，发现在1000 nm处发射峰减少，在840 nm处出现新的发射峰。近160 nm的大发射位移和分离良好的双发射带表明NIR-II-H2S2对H2S2具有优异的NIR-II荧光比例响应行为。荧光强度比（I840/I1000）提高了约107倍，并与H2S2浓度呈线性关系。基于荧光比计算得到NIR-II-H2S2对H2S2的检出限（3σ/k）在1.8 nM左右，与之前报道的值相当，[9b, 9d, 9g， 表明NIR-II-H2S2可以在较低浓度下有效检测H2S2。
NIR-II-H2S2穿透深度研究及外源H2S2成像
实现足够的信号穿透一直是荧光成像在体内的挑战，特别是在研究位于体内深处的生物结构时。为了评估NIR-II- H2S2的组织穿透能力，我们使用含有NIR-II- H2S2（NIR-II染料的代表）或Cy-Cl （NIR-I染料的代表）的毛细管进行了脂内幻象成像，将其浸入1%的脂内溶液中，在指定的幻象深度模拟组织。如图所示，niri - H2S2在NIR-II区域（> 1000 nm）的管边界即使在浸泡深度为7 mm时也能清晰识别，而Cy-Cl在NIR-I区域则显得模糊且无法区分。NIR-II-H2S2的穿透深度（7 mm）是Cy-Cl （1 mm）的近7倍。此外，在模拟生物组织的5毫米深度，NIR-II-H2S2的信本比（SBR）（约11.3）比Cy-Cl（约1.1）高约10倍。NIR-II-H2S2具有更高的成像分辨率和对比度，适用于体内深部组织成像应用。探针的生物相容性是体内成像应用的先决条件。因此，对NIRII-H2S2的生物相容性进行了评价。最初，在活细胞中使用传统的3-（4,5-二甲基噻唑-2 -基）-2,5-二苯基溴化四唑（MTT）测定法评估NIR-IIH2S2的潜在细胞毒性。如图所示，即使在25 μM的浓度下，细胞存活率也超过80%，证实了良好的生物相容性。为了评估NIR-II-H2S2在体外检测H2S2的潜力，我们首先在离心管中进行了NIR-II FL/PA双比例成像实验。在没有Na2S2的情况下，NIR-II-H2S2的NIR-II荧光成像比在0到30分钟的时间内变化最小，保持在约1.82±0.05的值。加入Na2S2后，随时间的推移，对应的荧光比从1.81±0.03上升到6.92±0.06，大约增加了3.8倍。同样，单独NIR-II-H2S2的PA信号比稳定在0.92±0.03左右；然而，随着Na2S2的引入，PA比增加了一倍多，达到2.20。结果表明，在添加Na2S2的试管中，NIR-II FL/PA比值显著改变，从而证实了NIR-II-H2S2在离体检测H2S2的有效性。
为了评估NIR-II-H2S2作为检测外源性H2S2的化学工具在体内的检测能力，将探针和Na2S2通过腹腔注射（i.p.）注入小鼠腹腔。在30分钟的时间内监测探针的NIRII荧光和PA双比信号的变化。成像结果显示，注射探针和生理盐水后，NIR-II比值信号强度（I850/I1000）没有明显变化。相比之下，注射探针和外源Na2S2后， NIRII荧光信号强度在850 nm处随时间延长而增加，在1000 nm处下降，荧光强度迅速增加，在20分钟内达到平台期。NIR-II比值信号强度（I850/I1000）从0.83±0.02增加到1.94±0.01，增加了约2.33倍。此外，比例PA成像也显示出类似的趋势。相比之下，仅给予探针后，小鼠在两个通道（PA800和PA900）上的PA强度没有显着变化。然而，如图所示，与Na2S2相互作用后，PA信号强度在800 nm处增加，在900 nm处下降。因此，PA比值信号（PA800/PA900）从0.90±0.02增加到1.51±0.03，大约增加了1.70倍。三维多光谱光声断层扫描（3D MSOT）图像进一步证实，可以在体内特异性、直接观察到外源性H2S2在小鼠腹腔内的相对位置。
总结
我们首次成功构建了NIR-II FL/PA双比例探针NIR-II-H2S2，用于体内内源性H2S2的定量检测和可视化，该探针是基于新发现的H2S2介导的二噻唑形成反应。这一独特的反应对Na2S2具有非常高的选择性，而对其他生物RSS（包括GSH、Cys、Hcy、Na2S、Na2S4和S8）没有选择性。我们设计的探针NIR-II- H2S2由作为信号报告单元的NIR-II荧光团支架和作为识别位点的新型1,3二氯部分组成。值得注意的是，体外和体内实验表明，所获得的探针能够对Na2S2物种产生双比例的NIR-II FL （I840/I1000, 107倍）和PA （PA800/PA900, 6.5倍）反应，具有高特异性、优异的灵敏度、改善的水溶性和深入组织渗透能力。这一进展也标志着H2S2探针的发展取得了实质性的进步，因为之前报道的H2Sn探针无法准确区分深层组织中不同的H2Sn种类。此外，利用NIR-II FL/PA双比例成像的互补优势，我们成功地证明了该探针可以精确量化肝损伤小鼠肝深部组织中H2S2水平的波动。据我们所知，这是第一次使用NIR-II FL/PA双比例探针NIR-II-H2S2来阐明H2S2与LPS/ met诱导的肝毒性之间的关系。因此，本研究为了解H2S2在生活中的生物学功能提供了一个实用而有前途的工具。
参考文献
https://doi.org/10.1002/anie.202418378
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