荧光染料在活细胞成像中扮演着至关重要的角色，因为它们具有诸如高光稳定性和亮度等优点。然而，传统荧光染料的光漂白限制了单分子水平上的长时间观察。为了克服这些限制，研究人员开发了一种超级光稳定的有机染料Phoenix Fluor 555 (PF555)，它在没有抗光漂白添加剂的情况下展现出比常规有机染料长一个数量级的光漂白寿命。这种新型染料不仅能够提供更长时间的活细胞单蛋白成像，而且可以用于生理条件下表皮生长因子受体（EGFR）与网格蛋白包被结构之间的动态单分子相互作用的可视化。
PF555是通过大规模光蓝化四磺酸Cy5（TSCy5）获得的，并且其化学结构是一种不对称的花青结构，在其中一侧，传统的Cy3中的吲哚被3-氧喹啉取代。研究者们首先合成了大量的TSCy5作为AF647的简化类似物，然后利用高功率激光和恒定的氧气补充进行体外光蓝化，以生成PF555。高效液相色谱分析显示两个候选峰，而保留时间为20.05分钟的峰值负责超光稳定物种。高分辨率质谱确定了PF555的化学式为C30H36N2O13S4，与TSCy5相比，失去了一个CH2基团并添加了一个氧原子。核磁共振光谱分析揭示PF555是一种新的含酮花青类化合物，即3-氧花青染料。
PF555的最大激发波长为555纳米，最大发射波长为567纳米，具有额外的477纳米激发峰。该染料的摩尔消光系数非常高，达到1,940,000 M^-1 cm^-1，但量子产率较低，为0.013±0.0009。为了生物成像应用，研究者引入了氯代烷基（CA）基团来标记HaloTag融合蛋白。CA(O4)-PF555在玻璃和细胞表面具有低非特异性结合，这对其应用于活细胞单分子成像是非常有利的。
当使用488纳米激光激发时，PF555表现出与561纳米激发相似的荧光信号强度，显示出极高的光稳定性。此外，CA(O4)-PF555的加入并没有显著改变PF555的光物理特性，除了轻微增加了激发和发射光谱的肩峰。
PF555允许在无明显光漂白的情况下对EGFR内吞和再循环过程进行长达一小时的成像。同时，PF555使得长期单分子相互作用的可视化成为可能，捕捉到了之前未知的EGFR内吞分子事件。重要的是，PF555不会诱导EGFR聚集或干扰EGF诱导的EGFR内吞和再循环功能。
综上所述，PF555作为一种新型的光稳定有机染料，为活细胞成像提供了强大的工具，能够在单分子和群体水平下实现长时间尺度下的生理条件成像。未来的研究将集中在提高产量的方法上，包括基于反应机制优化反应路径或开发防止光蓝化过程中光漂白的新合成方法。
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https://doi.org/10.1038/s41592-024-02584-0
