β-半乳糖苷酶（β-Gal）作为一类重要的糖苷酶，在细胞衰老、癌症等疾病中扮演着关键角色。其活性的检测对于理解这些疾病的进展机制至关重要。传统方法如聚合酶链反应（PCR）、Western blotting等，虽然能够提供精确的结果，但操作复杂且需要破坏细胞结构，难以实现实时监测。近年来，荧光探针技术因其非侵入性、高灵敏度和实时可视化的优势逐渐受到关注。华东理工大学贺晓鹏教授与中国科学院上海药物研究所李佳研究员团队合作开发了一种基于荧光素（fluorescein）的新型荧光探针Gal-F，用于活细胞内源性β-Gal活性的成像。
研究人员通过引入半乳糖基团到含有氟甲基取代的荧光素衍生物上来构建Gal-F。未激活状态下，由于染料的螺环化作用，荧光被淬灭；当β-Gal去除半乳糖基后，荧光恢复并增强约210倍，最大发射波长位于524 nm。这种显著的荧光变化使得Gal-F成为一种高效的β-Gal活性传感器。此外，Gal-F在其他糖苷酶和水解酶存在下不会产生假阳性信号，显示出高度的选择性。
为了验证Gal-F的有效性，科学家们进行了详细的溶液表征实验。结果显示，在添加β-Gal后，Gal-F和对照样品Gal-OH（无共价蛋白结合能力）均表现出吸收峰从460 nm处显著增加，并伴随有强烈的绿色荧光发射。时间依赖性的荧光增强测试进一步证实了β-Gal对galactosyl基团的去除是渐进的过程。同时，线性关系研究表明，随着β-Gal浓度升高，荧光强度也随之线性增长，最低检测限达到0.0006 U mL⁻¹，优于已报道的类似探针。
接下来，研究团队将Gal-F应用于不同癌细胞系中进行细胞水平评估。通过对HeLa、HepG2等多种人类癌细胞系的研究发现，Gal-F能有效反映各细胞系内源性β-Gal表达水平，其中HepG2细胞表现出最强的荧光信号。使用siRNA干扰GLB1基因表达以及加入D-半乳糖作为β-Gal抑制剂处理后的细胞实验表明，Gal-F的荧光生成与β-Gal活性密切相关。更重要的是，Gal-F能够在细胞溶酶体内特异性地定位，并通过与邻近蛋白质形成共价键而保留在目标细胞内部，从而提高了检测精度。
最后，作者还利用Gal-F对诱导型SA-β-Gal（细胞衰老相关的β-Gal）进行了成像分析。通过X-Gal染色确认A549细胞经博莱霉素处理后产生了SA-β-Gal，并观察到明显的荧光增强现象。这不仅证明了Gal-F可以用于监测细胞衰老过程中SA-β-Gal的变化，而且揭示了溶酶体数量随细胞衰老而增加的事实。Pearson相关系数分析显示，Gal-F与溶酶体追踪器之间的重叠程度从正常细胞的0.41提高到了衰老细胞中的0.74，进一步支持了这一点。
综上所述，该工作成功开发了一种名为Gal-F的小分子荧光生成标记探针，它不仅具有优异的灵敏度和选择性，而且能够准确捕捉到细胞内的β-Gal活性及其亚细胞定位情况。未来，Gal-F有望为化学糖生物学领域的多路复用成像提供更多可能性，促进我们对该类酶功能的理解及潜在应用价值的探索。
原文链接：
https://doi.org/10.1021/acsami.4c15268
