功能性核酸（FNAs）因其能超越传统信息传递角色而具备特定的生物功能，如疾病治疗中的靶向药物递送、诊断工具等，受到了广泛关注。然而，这些核酸在复杂的生理环境中容易被降解，从而限制了它们的临床应用。为了克服这一挑战，上海交通大学医学院附属仁济医院谭蔚泓院士/姬丁坤研究员团队提出了一种新颖的方法——通过精准分子编程设计出高稳定性的糖核苷酸适配体（glyconucleic acid aptamers, GNAAs），以期扩大FNAs的应用范围，并推动其从实验室走向临床。
研究中，作者们首先合成了四种适合商业固相合成使用的糖核苷酸模块，分别是半乳糖(Gal)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、葡萄糖(Glu)和甘露糖(Man)，并通过精确的分子设计实现了对DNA适配体特定位置上不同碳水化合物配体的修饰。这种修饰不仅显著提高了DNA适配体在血清中的稳定性，而且保持了其结构完整性和高亲和力。相较于现有的化学修饰方法，糖基化修饰展现出了更优越的效果。此外，实验结果表明，该方法不会影响DNA适配体对肿瘤细胞的选择性结合能力以及体内代谢特性。
具体来说，GNAAs体系构建的关键在于将上述四种天然糖配体引入到DNA骨架上形成新的核苷酸单元。这四个新单元作为合成模块，在后续步骤中可以像普通核苷酸一样参与DNA链的延长过程。当这些含有特殊修饰位点的核苷酸单元被添加到目标序列时，就形成了具有增强稳定性的GNAAs。为了验证这种策略的有效性，研究人员选择了几种已知的DNA适配体进行改造，并通过凝胶电泳、荧光定量分析等手段评估了它们在血清条件下的稳定性变化情况。结果显示，经过末端糖基化修饰后的Sgc8适配体即使在72小时后仍有约50%保持完好无损，远高于未修饰样本的表现。
进一步地，为了探究糖基化如何影响适配体与核酸酶之间的相互作用，研究团队进行了圆二色谱(CD)测量、熔点测试(Tm)、外切核酸酶抵抗实验以及分子动力学模拟等一系列实验。CD图谱显示，无论是原始还是修饰后的GalN-Sgc8都呈现出相似的手性特征；Tm值也几乎相同，这意味着糖基化并不干扰适配体本身的二级结构。更重要的是，在面对外切核酸酶攻击时，所有末端修饰版本均表现出更强抵抗力，尤其是5'端修饰形式最为突出。分子模拟则揭示了糖基化能够减少适配体与核酸酶之间接触面积的原因：相比于未修饰状态，修饰后的GalN-Sgc8与Exo1蛋白形成的氢键数量明显减少，导致两者结合能降低，从而减少了被降解的可能性。
最后，在细胞水平上，通过共聚焦显微镜成像观察发现，无论是在HCT116、MCF-7还是CCRF-CEM细胞系中，Cy5标记的GNAAs都能有效地与相应癌细胞表面受体相结合，并且内吞效率不受糖基化影响。流式细胞术测定得到的解离常数(Kd)进一步证实了这一点，即修饰并未削弱适配体对靶标的识别能力。同时，体内分布研究表明，Cy5标记的GalN-Sgc8注射入小鼠体内后，能够在肝脏、肾脏及肿瘤部位迅速积累并维持较长时间，证明其保留了良好的组织靶向性。最重要的是，病理切片染色结果显示，接受不同处理的小鼠主要器官均未出现明显的毒性反应，说明本研究所提出的糖基化策略是安全可靠的。
综上，该工作开发了一种简单经济且高效的策略来实现寡核苷酸类药物的精准糖基化修饰，为制备具有高稳定性的功能性核酸提供了新思路。这项工作不仅有助于解决当前FNAs面临的稳定性问题，也为未来相关疗法的研发奠定了坚实基础。
原文链接：
https://doi.org/10.1002/advs.202408168
