撰文：阿嫣 | 编辑：珊珊
当前的药物递送技术面临诸多挑战，如无法在确切的时间和部位递送药物；无法阻止药物的快速清除；无法预防因药物水平过高而导致的副作用，也无法防止因药物水平不足而产生的耐药性。
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最近，一种新的药物递送系统的出现，或能克服上述挑战。2024年10月，来自斯坦福国际咨询研究所(SRI International)的学者Harikrishnan Radhakrishnan等报告了一种新的药物递送系统。这种递送系统它可以在体内持续较长的时间，并能特异性地在疾病部位递送药物，递送的药量与疾病负荷成正比，且不影响健康组织，因此，可能用于治疗癌症、自身免疫性疾病和病毒感染等疾病。
该递送系统是将CD4 T细胞工程化改造成包含4-1BB但排除CD28胞内结构域的CD4 T细胞。在这种配置下，它们表现出更高的转导效率、更快的扩增速度，并能够长时间、特异性地在疾病部位生产更多治疗性蛋白质生物制品。
这种递送系统可以减少给药频率，从而提高治疗效果，并解决细胞疗法中的关键挑战。接下来，“细胞知聊”为你带来具体内容介绍。
一、传统药物递送系统的局限性
目前的递送平台涉及将药物包装到合成载体中，如脂质体、纳米颗粒、水凝胶、聚乙二醇化蛋白质。但这些传统的递送平台，存在不少局限：
1、剂量按体重或体表面积标准化计算，未考虑患者之间的差异或药物扩散到健康组织的情况。
2、药物释放遵循一级动力学，即随时间推移释放的药物浓度逐渐降低。
3、生物利用度受限于短半衰期和聚乙二醇化导致的活性减少，需要多次给药。
4、无法实现实时监控和个体疾病微环境给药。
5、不足的药物水平对快速生长的疾病细胞影响有限，使它们不受控制地生长，获得突变，并随着时间的推移演变成耐药性疾病。
6、宿主免疫反应(即针对合成载体的适应性和体液免疫反应)可能导致长期的免疫记忆，使合成载体在后续使用中失效。过量用药或能解决这一问题，但过量用药可能导致药物扩散到健康组织而引发其他疾病。
总之，当前的药物递送平台存在诸多局限，导致治疗效果受限，并且容易引发副作用或耐药性。这些问题在癌症、自身免疫性疾病和病毒感染等基于细胞的疾病中尤为突出。开发能够在时间和空间分辨率上精确递送药物的新平台，是未来治疗的关键方向。
二、利用T细胞生物学特性，开发一种新的药物递送系统
为开发一种更有效且对健康组织无害的新型药物递送平台，学者Harikrishnan Radhakrishnan最近报道了将原代T细胞工程化改造为在疾病部位进行细胞介导的蛋白质生物制品合成的研究。
他们的研究发现，当将T细胞开发为药物递送系统时，T细胞具有独特的生物学优势：
①可以通过化学趋向性迁移到疾病部位，并能通过分子特异性方式与靶细胞结合。
②在单细胞水平上，当T细胞遇到靶细胞表面的阈值抗原密度时，会触发一个二元(开/关)事件，并导致激活的T细胞克隆扩增。
T细胞的这些生物学特性使研究人员能够将其重新编程为一种基于细胞的平台，该平台在以抗原特异性方式与病灶细胞结合时激活，克隆扩增，并在疾病部位按疾病负担比例合成所需的蛋白质数量。
总之，研究人员旨在开发一种新型药物递送平台，通过利用T细胞的独特生物学特性，使其能够在疾病部位精确递送治疗性蛋白质。
不过，要将这项技术转化为临床相关系统，将面临两大挑战：开发一种可以大规模生产用于递送治疗性蛋白质的工程化原代T细胞的技术；提高原代T细胞合成所需蛋白质的数量，减少所需T细胞的数量。
三、基于CD4 T细胞的零级递送系统的设计原理和优势
基于零级T细胞的递送系统的合成途径包括：跨膜嵌合抗原受体(CAR)的抗原特异性细胞外部分，当识别到靶细胞上的抗原时，它会活化 T 细胞的细胞内核因子(NFAT)信号通路，并通过 NFAT 反应元件(NFAT-RE)诱导所需蛋白质的表达。
然而，这些工程化细胞在发挥细胞外功能时面临限制，主要是由于合成蛋白质的有限表达和制造的可扩展性方面的挑战。为了解决这些限制，研究人员假设使用辅助性CD4 T细胞而不是泛CD3 T细胞(包括CD4和CD8 T细胞)可能会提供一个解决方案。
这个假设的提出是基于这样一个事实：在抗原刺激的CD8 T细胞中，NFAT转录激活域中的53SSPS56基序的磷酸化受损，这限制了NFAT转录机制通过NFAT-RE进行信号传导。
图1.T 细胞递送平台示意图。当受到抗原呈递细胞激活时，CD4 和 CD8 T 细胞被改造用于实现递送功能。
相比CD3 T细胞(包括CD4和CD8 T细胞)，使用CD4 T细胞作为递送系统具有明显优势：
CD4 T细胞中的NFAT转录激活域磷酸化不受损，而CD8 T细胞中的NFAT转录机制受损。
从CD4 T细胞群体开始可以避免CD8 T细胞的主导地位。
这项研究表明，与CD8 T细胞相比，CD4 T细胞将特定蛋白质运送到疾病部位的效率更高。通过包含4-1BB胞内结构域而排除CD28胞内结构域的CAR，CD4 T细胞表现出三倍的转导效率、两倍的扩增率和五倍的目标蛋白表达量。
研究人员还使用识别叶酸受体α(FRα)的CAR验证了CD4 T细胞递送系统的有效性。CAR的可适应设计使递送平台能够重新定向识别其他抗原。
为了验证基于CD4 T细胞的方法用于递送功能性治疗药物的有效性，研究人员使用其递送干扰素-β(IFNβ)，结果发现干扰素-β在动物腹腔内植入的卵巢癌细胞中产生了抗肿瘤效果。
这项研究结果表明，CD4 T细胞的零级递送系统在递送治疗性蛋白质方面存在显著优势。
通过优化CAR的设计，可以克服现有的局限性，提高递送效率和治疗效果。使用CD4 T细胞作为基础，可以更好地发挥NFAT信号通路的作用，从而增强治疗效果。此外，该系统还可以通过调整CAR的设计来识别不同的抗原，提高其适应性，拓展其应用范围。
实验结果
1、用于递送平台的T细胞表型对治疗效果的影响
T细胞表型直接影响治疗效果，包括剂量生产效率和治疗性蛋白质的合成。
研究人员探讨了CD4和CD8 T细胞在体外的转导、扩增和抗原诱导递送功能的动力学。
1)CD4 T细胞扩增效率更高
新鲜分离的外周血CD3 T细胞中初始CD4与CD8的比例明显偏向CD4(CD4:CD8 = 7:1)，并且在第10天之前几乎没有变化。当延长扩增时间以达到临床相关剂量所需的细胞数量时，观察到数量向CD8 T细胞的倾斜。在转导CD3 T细胞后扩增25天发现，CD4与CD8的比例变为1:2。
图2.工程化用于递送功能的CD3 T细胞在25天内扩增，并在第5天和第25天评估CD4和CD8表型的分布。
在最大化生产细胞毒性CD8 T细胞的治疗中，这种数量倾斜可能不是问题，但对于依赖NFAT途径的递送功能来说，CD8 T细胞中受损的NFAT途径限制了它们表达工程化蛋白质的能力。
从培养同一供体的CD3 T细胞群体开始(第0天时CD4:CD8 = 7:1)时(P < 0.01，在所有超过第0天的时间点)，只获得了大约7倍的扩增。相比之下，当单独培养原代CD4 T细胞时，在转导后8天观察到了约14倍的扩增。
图3.使用匹配供体的工程化CD4 T细胞和CD3 T细胞(包含CD4和CD8)用于递送后进行扩增。
2)CD4 T细胞的转导效率高于CD8 T细胞和CD3群体
通过比较CD4和CD8表型转导效率的结果，进一步说明了选择工程化CD4 T细胞作为递送平台的原因。
考虑到人类遗传多样性带来的变异，研究人员使用三位人类供体重复了实验三次。结果显示，与CD8 T细胞相比，CD4 T细胞不仅扩增速度更快(约2倍)，而且转导效率更高(约3倍)。
图4.通过流式细胞术测量FRα-CAR表达来评估T细胞的转导效率，在转导后5天进行测量。
除此外还观察到，与CD8 T细胞相比，CD4 T细胞表现出更强的向趋化因子CCL5和CCL17趋化迁移的倾向。这些趋化因子在肿瘤微环境中自然富集，并在将T细胞募集到肿瘤部位中起重要作用。
2、不同CAR胞内结构域组合对CD4 T细胞性能的影响
初步实验使用了一个第三代CAR，该CAR除了CD3ζ结构域外，还包括了CD28和4-1BB的胞内结构域。
在接下来的步骤中，研究人员评估了细胞内CAR结构域的三种组合对CD4 T细胞性能的改善，及其作为递送平台的潜力。
三种CAR构建包括：
仅包含CD28胞内结构域(28ζ)；
仅包含4-1BB胞内结构域(BBζ)；
串联包含CD28和4-1BB胞内结构域(28-BBζ)。
图5.将T细胞转变为药物递送平台的不同CAR(嵌合抗原受体)的设计示意图：(A) 28-BBζ CAR，(B) 28-BBζ T细胞递送平台，(C) 28ζ T细胞递送平台，(D) BBζ T细胞递送平台，(E) BBζ T细胞递送平台，来自IFN alpha-2的信号肽，用于指导蛋白质的正确定位和加工。
研究结果显示，虽然CD4 T细胞的转导效率并不依赖于CAR中使用的胞内结构域组合，但工程化蛋白质的表达水平则取决于这些结构域组合。
图6.使用匹配供体的CD4(100%)和CD8(100%)T细胞，使用不同胞内结构域的CAR(28ζ、BBζ和28-BBζ)用于递送功能(n = 3供体)评估。
图7.使用匹配供体的CD4(100%)和CD8(100%)T细胞，使用不同胞内结构域的CAR(28ζ、BBζ和28-BBζ)工程化用于递送功能评估，并与OVCAR3靶细胞共培养。量化NFAT-RE诱导的报告基因(Nluc)的活性以评估不同胞内结构域对CD4和CD8 T细胞表型递送功能的影响。
研究结果表明，三种CAR中，BBζ CAR在CD4和CD8 T细胞递送平台中均更有效地诱导工程化报告酶。CD4 T细胞中的BBζ CAR诱导的报告酶活性，比在CD8 T细胞中高出约5倍，并且是对抗原呈递靶细胞（在这种情况下为FRα+ OVCAR3细胞）的特异性响应。
与28ζ CAR相比，BBζ CAR也被报道赋予CAR T细胞其他理想的特性，如增强CAR T细胞持久性、减少持续性信号，患者耐受性更好（细胞因子释放综合征和细胞治疗相关神经毒性较低）。
通过对比不同CAR胞内结构域组合的效果，研究发现BBζ CAR在CD4 T细胞递送平台中表现出更高的工程化蛋白表达水平，并且具有其他理想的特性。这些发现支持了选择BBζ CAR作为CD4 T细胞递送平台的胞内结构域组合，以提高治疗效果。
3、CD8 T细胞中使用NFAT-RE转录起始位点时，工程化蛋白质表达减少的原因
接下来，研究人员验证了他们的假设，即在CD8 T细胞递送平台中使用NFAT-RE转录起始位点时，工程化蛋白质表达水平会出现减少的情况，原因可能是受损的NFAT转录机制。或者是由于FRα特异性的CD8 T细胞递送平台对呈递抗原的靶细胞产生细胞毒性作用，进而导致抗原刺激减少。
为了验证这一点，研究人员使用功能化处理的人FRα抗原和抗人CD28抗体的微珠代替OVCAR3细胞作为抗原呈递靶标，使用抗CD3和抗CD28抗体的功能化微珠作为阳性对照，模拟T细胞活化的完全条件，使用未经刺激的CD4和CD8 T细胞作为阴性对照。
在这项实验中使用微珠消除了由于CD8 T细胞溶解呈递抗原的靶细胞而导致的刺激损失。结果显示，在CD8 T细胞中生物发光报告酶的活性高约5倍，在CD4 T细胞中活性高约12倍。
图8.在使用微珠刺激时，工程化用于递送功能的CD4和CD8 T细胞(使用BBζ CAR)的Nluc活性比较。
结果发现，尽管CD8 T细胞中存在NFAT调控表达，但这种表达在CD4 T细胞中大约高7倍。这验证了CD4 T细胞递送平台具有更明显的NFAT转录机制，而这种机制在CD8 T细胞中受损。
4、工程化CD4 T细胞在体内和体外的细胞溶解活性和递送功能
为验证工程化CD4 T细胞在体外的细胞溶解活性，研究人员使用工程化表达FRα特异性CAR的CD4和CD8 T细胞作为实验对象，与工程化用于呈递FRα的靶细胞(即FRα+A2780cis细胞)共同孵育。靶细胞也被工程化用于表达Luc2酶，这是一种依赖ATP的生物发光报告酶，用来标记活细胞。
结果证实，与具有相同抗原特异性(FRα)的CD3 T细胞递送平台相比，CD4 T细胞递送平台细胞溶解活性更低(CD4:CD8 = 1.5:1)，选择CD4 T细胞用于细胞递送系统是正确的选择。
图9.使用匹配供体的FRα-CAR CD4和FRα-CAR CD3 T细胞(工程化用于递送功能)对FRα+肿瘤细胞(A2780cis-FRα+Luc2+)的溶解活性的评估。未修饰的CD3 T细胞作为阴性对照。
因此，经过工程改造的 CD4 T 细胞可以增加的耐受剂量进行递送，表达更多所需的蛋白质，而不会出现杀伤健康细胞(这些细胞可能表达基础水平的靶抗原)的不良副作用。
为了验证CD4 T细胞递送平台在体内的工程化功能，研究人员将卵巢癌细胞系A2780cis转入免疫缺陷小鼠腹腔（模拟卵巢癌患者的腹膜转移），并用工程化用于表达Nluc报告酶的CD4 T细胞进行抗肿瘤治疗，并在多个时间点对Nluc活性进行成像和量化，以验证其递送功能。
结果显示，与对照组相比，在产生Nluc的FRα-CAR+ CD4 T细胞中观察到了递送功能的增强。
此外，通过使用阴性对照——具有相同诱导递送功能但没有CAR(No CAR-Nluc)的CD4 T细胞，以及没有NFAT-RE诱导递送功能的FRα特异性CD4 CAR(CAR-BBζ)T细胞，验证了CD4 T细胞递送平台具有抗原特异性递送功能。
图10.卵巢癌转移模型小鼠腹腔的生物发光图
图11.对NFAT-RE诱导的效应器(Nluc)活性测量结果的量化
这些结果还表明，CD4 T细胞平台或能应用于抗原和血清学测试以进行体内感应。这项技术可用于监测疾病进展、评估治疗反应以及递送治疗性蛋白。
5、工程化的CD4 T细胞在体内具有IFNβ的递送功能
在下一步中，研究人员通过更换生物发光报告酶的核苷酸序列，使用抗肿瘤细胞因子干扰素β(IFNβ)，验证了CD4 T细胞的递送功能。
使用功能化处理的FRα抗原和抗CD28抗体的微珠，再次确认了之前的观察结果，即CD4 T细胞可以通过NFAT转录机制合成治疗性蛋白质。
图12.在FRα抗原/抗CD28磁珠(细胞与磁珠比例=1:3)刺激下，用于递送的工程化T细胞(CD4，CD8，以及含有CD4和CD8的CD3)分泌的IFNβ。
与泛CD3 T细胞和杀伤性CD8 T细胞相比，用于递送的辅助性CD4 T细胞递送平台产生的IFNβ多出两倍，证实了其增强的抗原特异性递送功能。阴性对照(未刺激的CD3、CD4和CD8 T细胞，均工程化用于IFNβ递送)分泌的IFNβ极低。
将产生IFNβ的工程化CD4和CD8 T细胞的上清液，处理各种细胞系，如黑色素瘤(SK-MEL-147，WM88，SEKI)，乳腺癌(CAL-51，SUM52PE)，卵巢癌(OVCAR3，A2780cis)细胞系和非癌细胞系(HEK293T/17)时，IFNβ具有抑制靶细胞生长的作用。
图13.评估由CD4和CD8 T细胞递送平台分泌的IFNβ对黑色素瘤(SK-MEL-147，WM88，SEKI)、乳腺癌(CAL-51，SUM52PE)、卵巢癌(OVCAR3，A2780cis)细胞系以及非癌细胞系HEK293T/17的生长抑制作用。
观察到在八个细胞系中的五个(SK-MEL-147，WM88，SUM52PE，A2780cis和OVCAR3)具有生长抑制作用，这表明在考虑将此方法作为治疗选项之前，需要预先评估肿瘤对IFN-β的敏感性。
最后，为了验证用于分泌IFNβ的工程化CD4 T细胞递送平台在体内的治疗效用，研究人员使用它来治疗抗原阳性肿瘤(FRα+ Luc2+ A2780cis)。结果显示，与不产生IFNβ的对照FRα-CAR+ T细胞相比，在产生IFNβ的FRα-CAR+ T细胞中观察到了显著的肿瘤细胞减少，表现为发光减少，这表明CD4 T细胞递送平台确实产生了功能性治疗剂。
图14.分泌IFNβ的工程化CD4 T细胞递送平台对FRα特异性肿瘤细胞的靶向作用，肿瘤生物发光的量化结果。
研究人员通过计算发现，CD4 T细胞递送的IFNβ剂量比直接使用rhIFNβ剂量少约300倍，但疗效更佳。
通过评估直接注射rhIFNβ、使用不产生IFNβ的对照FRα-CAR+ T细胞，以及使用产生IFNβ的FRα-CAR+ T细胞三种方法对肿瘤小鼠的治疗效果，结果发现，使用产生IFNβ的FRα-CAR+ T细胞治疗的小鼠，其生存率显著提高，而直接使用rhIFNβ并未显示生存优势。治疗过程中未观察到明显的毒性。
这些发现支持了CD4 T细胞作为递送平台的有效性和特异性，并展示了其在肿瘤治疗中的潜力。
图15.工程化用于分泌IFNβ的CD4 T细胞递送平台对FRα特异性肿瘤细胞的靶向作用，各组小鼠的存活率百分比(每组6只)。
结语
这项研究表明，工程化的CD4 T细胞作为递送平台在评估疾病负担并作出响应方面具有显著优势。当其作为细胞递送平台时，相比于杀伤性CD8 T细胞或CD4和CD8 T细胞的组合(即泛CD3 T细胞)，辅助性CD4 T细胞更具竞争优势。
通过优化转导方法和扩增方法，工程化的CD4 T细胞有助于解决临床应用中的两个关键问题：扩大细胞生产和增加治疗性蛋白的合成。
CD4 T细胞递送系统的低细胞溶解活性也为递送平台提供了实质性的优势，即工程化用于药物递送的CD4 T细胞的最大耐受剂量可以很高，而不会对健康组织产生影响。
选择CD4 T细胞而非CD8 T细胞的主要原因可能是，CD4 T细胞中的NFAT转录机制更为高效。
研究还表明，CD4 T细胞作为递送平台在治疗实体瘤方面具有显著优势。与直接给药相比，CD4 T细胞递送平台不仅剂量更低，效果更佳，不良副作用更少，展现出在未来治疗应用中的巨大潜力。
参考文献：
Radhakrishnan H, Newmyer SL, Javitz HS, Bhatnagar P. Engineered CD4 T cells for in vivo delivery of therapeutic proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024 Oct;121(40):e2318687121. doi: 10.1073/pnas.2318687121. Epub 2024 Sep 23. PMID: 39312667; PMCID: PMC11459198.
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