撰文：白露Eileen | 编辑：珊珊
尽管CAR-T细胞疗法在临床上取得了成功，但许多患者对其耐药而没有获益，这通常与CD8+ T细胞反应失败相关。因此，探索高效CD8+ T细胞免疫的分子驱动因素和机制，及如何利用这些发现来改善治疗结果，依旧意义重大。
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2024年9月，《Frontiers in Immunology》杂志发布了一篇题为“Transcriptional rewiring in CD8+ T cells: implications for CAR-T cell therapy against solid tumours”的综述，其旨在讨论解码和重新连接细胞转录网络的新方法，汇总临床前T细胞治疗中靶向转录因子的新观点，以及这一策略的结果，尤其针对实体瘤。“细胞知聊”本期将给大家分享其主要内容。
背景简介
活化的CD8+ T细胞亚群非常多样化。在急性感染中，CD8+ T细胞可以变为短暂存活的效应细胞清除感染细胞，也可以成为宿主有长期免疫力的静态(quiescent)记忆群体。同时，慢性感染或癌症中由于持续抗原暴露，使T细胞产生了额外的“耗竭”表型谱系，其功能和干细胞样特征各不相同。这些不同表型的形成来源于一系列细胞外信号，例如抗原信号的强度、细胞因子环境、细胞间通信以及接触到的代谢物和营养物质。转录因子在建立这些异质细胞表型中起着至关重要的作用，在塑造CD8+ T细胞的活性和维持中发挥着核心作用。重要的是，这些不同表型之间的平衡决定了CD8+ T细胞反应的质量，包括利用这一免疫群体的治疗产品的效力。
转录因子是一类结合到DNA中的关键调控元件上的蛋白质，以调节基因表达并引导细胞的发育轨迹。转录网络指导细胞的发育程序，调节着胚胎干细胞分化成遍布全身的众多独特细胞类型。
由于新型基因工程平台、生物信息学方法和高通量筛选工具的出现，支撑有效CD8+ T细胞的众多转录网络被揭开。识别和调节这些网络的转录因子作为可操作的分子靶点，能增强细胞疗法的有效性，以期将其临床应用扩展到难治的实体瘤领域。
使用转录因子重新调整CAR-T细胞
转录网络在T细胞的生命周期中驱动着显著多样的表型和功能变化(图1)。
图1. 当前关于CD8+ T细胞的多样性和分化以及与各种表型状态相关的转录因子的范式，箭头指示分化轨迹。
转录因子通常被分类为基因表达的抑制剂或激活剂，尽管某些蛋白质在不同场景下可激活或抑制的功能。基因表达的调节是通过在启动子或增强子——远端调控区域的结合来介导的。虽然一些转录因子可以作为单一功能单元运作，但有些必须二聚化。此外，这些二聚体可以结合额外的辅助因子来在复合元件位点介导激活或抑制。翻译后修饰在调节转录因子活性中起着重要作用，不同的修饰根据目标蛋白推动特定的结果。例如，磷酸化的激活T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)在细胞静息的状态下存在于细胞质内，而某些干扰素调节因子(interferon regulatory factor，IRF)或信号转导和激活转录蛋白(STATs)的磷酸化可激活这些转录因子，是核转位(nuclear translocation，即进入细胞核)的必要条件。最终，细胞的转录活性的内源性控制是通过整合上游信号来协调各种刺激诱导的基因表达的适当变化。因此，转录因子网络协调T细胞分化，整合了一系列刺激信号，如抗原刺激、细胞间交流和环境诱因。
初始T细胞在寻找同源抗原时，转录程序维持其静止状态。这涉及到通过重要转录因子如BCL2和LEF1对效应相关基因的表观遗传和转录沉默，以及通过例如抑制炎症趋化因子受体KLF2来维持常规初始T细胞迁移模式。一旦T细胞接收到三个必要的激活信号，这个程序迅速下调，允许控制效应分化和克隆扩增的转录体系接管协调。T细胞受体(TCR)反应的转录因子如NFAT和IRF4，以及由共刺激诱导的转录因子，如c-Jun和NF-κB，整合起来协调细胞必要的分子重编程。这些转录程序进一步通过细胞因子微调，如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15和I型IFN信号。随着所有激活信号传递给T细胞，这些转录网络可诱导其强大的增殖、代谢重调整、效应分化和迁移到病原体或恶性损伤的部位。相比之下，当信号传递不完整时，耐受程序会被启动来限制T细胞反应来避免对自身的伤害。
短暂存活的效应细胞在抗原威胁被终止后从系统中清除。早期激活的T细胞还产生了一小部分注定要存活并形成记忆的效应细胞——记忆前体效应细胞。它们的命运是由持续表达驱动长寿和干细胞性的转录因子决定的，以及较低水平的效应相关转录因子，如IRF4和BLIMP1。有些与长寿相关的转录因子与初始转录程序共享，如TCF1。
在记忆形成期间，好几个转录网络并行运行，产生一些具有独特分化状态、迁移模式和功能能力的亚群，以提供全面的长期保护。其中包括两个循环群体——中央记忆T细胞(T_CM)和效应记忆T细胞(T_EM)——以及一个稳定驻于外周组织的亚群——组织驻留记忆T细胞(T_RM)。T_CM采用与初始T细胞相似的迁移模式，利用共享的转录因子如KLF2来调节其过程。相比之下，效应T细胞转录程序的低水平活性可能使T_EM比T_CM处于更终端分化的状态，并使其可通过血液和外周器官迁移。此外，机体存在一个涉及RUNX3、BLIMP1和HOBIT的特别组织驻留程序，来管理T_RM区室，在先前的抗原侵害现场提供局部监视。
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在某些疾病中，如癌症或慢性感染，T细胞的表观遗传和转录多维特征逐渐被重塑，以产生耗竭的独特表型状态。在过去的几年里，人们对耗竭T细胞(T_EX)的理解已经扩展，认识到T_EX群体的异质性，这其中转录因子可能发挥了重要作用。驱动静止(quiescence)和自我更新的转录因子包括T细胞因子-1(T cell factor，TCF1)、抑制DNA结合3(Inhibitor of DNA Binding，ID3)和BACH2，维持了一个祖细胞耗竭T细胞(T_PEX)池。围绕T_EX亚群的定义不断演变。然而，该领域聚焦在至少两种不同分化方向的存在：(i)效应耗竭细胞，提供强大的细胞毒性效应；以及(ii)终末分化的耗竭T细胞，其细胞毒性差，缺乏细胞因子产生。
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恶劣的肿瘤微环境(TME)改变了营养物质和氧气的状况，最终影响了浸润T细胞的转录程序。例如，TME中较低的氧气水平推动了低氧诱导因子(HIF)的活性，这其被认为能让细胞适应恶劣环境。
转录因子及其下游效应赋予CD8+ T细胞一系列表型状态，与接受过继细胞疗法(ACT)患者的临床结果相关。例如，干细胞性已被认为是与CAR-T细胞持久性改善和持久缓解相关的特征；将T细胞转录重构为混合自然杀伤(NK)样表型可以克服MHC限制。随着DC-T细胞相互作用中涉及的转录网络的新揭示，转录因子靶点可增强诸如表位扩散等重要效应，无疑将有助于克服识别靶抗原有限这一关键障碍。
由于T细胞分化过程中时空调控模式的复杂性，识别驱动对癌症有效T细胞免疫的转录因子仍然是一个重大挑战。近年来，分子和生物信息学平台的巨大进步可提高洞察机制的效率。
无偏倚(unbiased)策略用于优先选择新的转录因子靶点
生物信息学方法中的in silico分析加速了药物发现，超越了传统“还原论(reductionist)”(有偏倚[biased])方法的能力。作为癌症免疫治疗研究的前沿，捕捉表观遗传和转录组信息(批量和单细胞水平)的下一代测序技术有望解开抗肿瘤T细胞反应的异质性。这个过程通常涉及利用临床前和临床模型，特别是那些结果不同的模型，通过下一代测序来剖析这些模型，以优先考虑下游实验验证的候选者。譬如，评估ATAC-和RNA-seq数据的整合分析发现了KLF4作为一个新的转录调节因子的重要性，它在MC38小鼠肿瘤中重新激活了耗竭的CD8+ T细胞；同时分析单细胞分析染色质状态和RNA的新技术，在CAR-T细胞中也揭示了FOXP1和KLF2作为干细胞性和效应功能的相互调节器。除了涉及这些技术的传统分析外，人们特别开发了一系列in silico预测工具，以从组学数据中进一步探讨机制，以识别新的转录调节器。这些工具的每种计算方法都有其独特的优势和局限性：
1)基因调控网络(Gene regulatory network，GRN)推断方法如ARACNe、GENIE3和WGCNA从转录组数据中揭示复杂的调控相互作用，但计算量大，可能会产生含杂讯的GRN。
2)基序富集分析工具，如HOMER，通过DNA基序分析预测TF结合位点，但可能过度简化预测，并不能捕获继发或间接目标。
3)转录因子活性评分方法，如DoRothEA和VIPER基于基因表达估计TF活性，但由于依赖先验(priori)信息，其范围有限。
4)由一系列单细胞技术产生的多组学信息，捕获转录组和表观遗传信息。SCENIC算法可以从单个细胞衍生的转录组数据中预测TF活性，但scRNA-seq技术固有的数据稀疏性(sparsity)会限制转录因子-靶基因预测的分辨率。整合多组学方法如MARINa和CellOracle结合了scRNA-seq和ChIP-seq中的基因表达和TF结合数据，以生成更强大的预测模型。SCENIC和GENIE3等工具/计算框架可从转录组数据中识别各种人类癌症图谱数据集，挖掘新转录网络，涉及TIL活性以及CAR T细胞的长期持久性。
需要注意的是，这些计算框架仅作为预测工具，需要严格的实验室验证。当与体外高通量筛选工具和CRISPR/Cas9基因编辑系统结合使用，其研究结果可揭示特定转录因子程序在肿瘤特异性CD8+ T细胞和Treg群体中的重要性。
当前用于调控基因表达的工具
可用来调控转录因子的表达策略包括使用细胞因子、化学药物、免疫调节剂和调节营养物质水平等，而基因工程能够操纵任何已知基因，具有高度针对性(图2)。基因工程平台在基因组(例如CRISPR-Cas9、逆转录病毒过表达)或转录组(例如CRISPRi、CRISPRa、shRNA、siRNA、mRNA转染)水平直接针对靶基因，从而改变或影响细胞的基因表达。遗传工程策略的基本优势在于细胞的转录组很大程度上可定制。在CAR-T细胞中操纵转录因子大致可分为旨在减弱或增强其表达。
图2. 使用化学药物、代谢物、细胞因子、生物调节剂和基因工程改变基因表达。
减少产生较差表型的转录因子表达，可避免细胞产物转为较差的表型亚群，和/或促进有效的群体。这些工具有：
CRISPR-Cas9系统可引入功能丧失的突变而从基因组中永久性地失活目标基因。CRISPR技术的新型迭代，特别是CRISPR干扰(CRISPRi)，也可实现目标基因转录的暂时抑制。
小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)可暂时抑制或敲除基因表达，将它们的序列整合到病毒载体中可稳定下调目标基因。
Cre/lox系统是小鼠中用于遗传删除的复杂工具，能在不同启动子下通过诱导表达Cre重组酶在指定时间和细胞亚群中高效消除基因。但Cre/lox系统只能用于小鼠模型，仅有助于加深人们对基因的基本理解。
增加驱动优越表型的转录因子表达，可丰富有效的细胞亚群。这些工具有：
逆转录病毒是一种常用的工具，以实现目的基因的组成性过表达。逆转录病毒过表达的好处包括表达稳定和有效，在临床前研究中使用最广泛。
HDR-CRISPR方法可实现目的基因的稳定表达，可避免基因组随机整合(如引入有害突变)。
mRNA或DNA转染可实现短暂的野生型基因表达。
CRISPR激活(CRISPRa)可实现目标基因的扩增。
改善CD8+ T细胞抗肿瘤免疫的机制
迄今为止，在CD8+ T细胞中，人们已经使用上述方法调控了多种转录因子。工程化降低或增加转录因子活性，通过赋予过继细胞产品一系列功能或表型优势，可改善CD8+ T细胞驱动的抗肿瘤免疫以提高抗肿瘤效力。
降低活性改善抗肿瘤免疫的机制(转录因子：作用/机制；瘤种)：
限制耗竭
NFAT5：驱动耗竭样程序；黑色素瘤。
TOX(2)：促进耗竭；黑色素瘤和肝细胞癌。
NR4A(1，2，3)：负向调节发育中和激活的CD8+ T细胞的存活和功能；淋巴瘤和黑色素瘤。
限制耗竭和改善持久性
- B淋巴细胞诱导的成熟蛋白-1(B lymphocyte-induced maturation protein-1 ，BLIMP1)：抑制记忆相关基因，诱导细胞裂解分子；黑色素瘤和前列腺癌。
促进记忆表型
- 基本亮氨酸拉链转录因子ATF样3(basic leucine zipper transcriptional factor ATF-like 3，BATF3)：促记忆CD8+ T细胞；乳腺癌。
促进T_EX分化和功能
- ETS1：促静止，驱动其他类似干细胞的转录因子；黑色素瘤。
克服MHC限制
- BCL11B：在发育过程中保护T细胞特征，特别是防止NK谱系的转变；晚期实体瘤。
增加活性改善抗肿瘤免疫的机制(转录因子：作用/机制；瘤种)：
限制耗竭
- c-Jun：介导激活，确保强大效应群体的扩增；骨肉瘤和肝细胞癌。
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限制耗竭和促进干细胞特性
- TCF1：促与自我更新、记忆和静止相关的T细胞表型；黑色素瘤。
- BATF(1)：既是效应分化的驱动因素(黑色素瘤)，也是记忆的抑制因子(胰腺癌)。
促进干细胞特性
- ID3：调节干细胞特性和记忆；肝肿瘤。
- c-Myb：调节干细胞特性和记忆；黑色素瘤。
促进干细胞特性和记忆表型
- FOXO1：干细胞特性的调节器，促记忆性和长期存活；乳腺癌、结肠癌、卵巢癌和骨肉瘤。
促进效应功能和积累
- RUNX3：驱动组织驻留；黑色素瘤。
- HIF-1α + HIF-2α：适应低氧；黑色素瘤和结直肠癌。
其他：
增加活性增强效应功能和降低活性促进记忆表型
- IRF4：一些研究表明IRF4具有诱导耗竭的功能，而其他研究则认为它对持续的细胞毒性活动至关重要。
临床试验进展
临床前筛选管道和新技术已经成功地识别了一些可以调节的，以赋予CAR-T细胞对实体瘤的改善效力。
迄今为止，已有治疗实体瘤的、调节转录因子的CAR-T细胞进入初步的I期临床试验。过表达RUNX3的CAR-T细胞在治疗转移性肝细胞癌中已显示毒性可控。BCL11B删除产生的NK样T细胞在治疗MHC低或MHC阴性的晚期实体瘤的临床研究中，九名患者已有初步结果：接受治疗的三分之二患者有临床获益(疾病稳定或部分缓解)，没有发生毒性。因此，调节转录因子的T细胞产品正在成功地进入人体试验，展示了产生这类产品的可能性。与非转录因子调节产品的比较，可验证T细胞表型重构的治疗效果。
参考文献：
Srinivasan S, Armitage J, Nilsson J, et al. Transcriptional rewiring in CD8+ T cells: implications for CAR-T cell therapy against solid tumours. Front Immunol. 2024 Sep 27;15:1412731. doi: 10.3389/fimmu.2024.1412731. PMCID: PMC11466849.
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