撰文：白露Eileen/乱步江南 | 编辑：珊珊
CAR-T细胞治疗已成功从临床前实验转化为临床应用，以及转化为可产业化规模制备的产品。随着CAR-T细胞产品在患者上广泛应用，大量经验和数据累积，为CAR-T细胞作用机制的解析、治疗的优化、有效性和安全性的预测、以及细胞输注后的监测提供了有意义的参考。
转化医学是连接实验室与临床科室的桥梁。基于使患者最大获益为目的，在CAR-T细胞这种复杂精细的药品应用到人体的过程中，转化医学科学家们发现和验证了许多与疗效和副作用相关的生物标志物；同时，以转化医学为桥梁，研究人员不停穿梭往返于临床与临床前，更新进化理论与实践，使CAR-T细胞发挥最大疗效和减少毒性。
CAR-T细胞治疗相关的生物标志物涵盖患者器官组织维度上的疾病负荷、细胞水平和蛋白分子水平、以及基因维度上的特点。在时间纵向层面，这些生物标志物可分布在细胞输注前到输注后长达几年时间。CAR-T细胞转化医学研究不仅在肿瘤领域有众多成果，在自身免疫疾病(AID)领域也有新发现。
“细胞知聊”本期为大家梳理和归纳既往30篇以上有关CAR-T细胞转化医学研究的相关文章，旨在温故知新。
图1. CAR-T细胞转化医学研究总览
患者状态
肿瘤负荷
CAR-T细胞输注前患者本身的肿瘤负荷与CAR-T细胞的有效性和安全性密切相关。
高肿瘤负荷会引起高水平的全身性炎症和免疫失调，以及高度不利的肿瘤微环境(TME)，对CAR-T细胞产品的生产、扩增、抗肿瘤活性和持久性产生负面影响。譬如，通过影响原始T细胞的质量和数量而降低CAR-T细胞的转导效率和体内扩增能力；可引起循环T细胞耗竭、减少T细胞的数量；促进抑制性细胞活化或增多和分子表达来降低CAR-T细胞的活性。同时，高肿瘤负荷的患者中更频繁地出现严重的CRS和ICANS。
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肿瘤负荷与复发风险的临床发现可转化为对改进临床治疗的提示。譬如，在一项CD19 CAR-T细胞治疗B-ALL的研究中，骨髓含≥5％母细胞的患者分为高肿瘤负荷(HTB)组，而<5％母细胞的患者为低肿瘤负荷(LTB)组。结果发现，白血病肿瘤负荷与较高的复发风险显著相关。其中，HTB组患者的复发率为83%，远高于LTB(42%)。HTB组患者的复发主要是CD19阴性(72%)，而LTB组患者的复发主要是CD19阳性(71%)。在LTB组患者中，所有CD19阳性复发之前均出现B细胞恢复。
该研究对于细胞治疗后的提示有：
对于HTB组患者，无论B细胞再生障碍(B cell aplasia，BCA)状态如何，都强烈建议使用Allo-SCT进行巩固性治疗。
所有B细胞恢复<3-6个月的HTB和LTB患者均可考虑Allo-SCT。
对于B细胞恢复>6个月的LTB患者，无论B细胞恢复时间如何，建议密切监测MRD并采取个性化策略。
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炎症及整体临床状况
细胞输注前，患者的炎症和疾病严重程度的基线实验室值可以预测CAR-T细胞疗效。
CD19 CAR-T细胞治疗B细胞恶性肿瘤患者的研究中，输注前免疫状态为高水平的IL-12、DC-Lamps、FAS配体和TRAIL表达，以及低水平的IL-6、IL-8、NAP3、sPDL1、和sPDL2表达，可能预测疗效良好。
清淋后的反应也可能是重要的预测指标。NHL患者在清淋后IL-7和MCP-1水平升高，经CD19 CAR-T细胞治疗后PFS会得到一定的延长。另一项研究发现，清淋后较高水平的IL-15是CAR-T细胞治疗后淋巴瘤缓解的预测指标。
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单采相关
目前为止，淋巴细胞单采产品中细胞特征研究主要集中在预测细胞产品的疗效。
在一项CD19 CAR-T细胞治疗DLBCL的研究中，一年内一线治疗失败或原发性难治性DLBCL患者的单采被归为早期采集/早期组，接受过至少两线治疗的患者为标准采集/标准组。
早期组的患者对细胞治疗的应答显著更佳：早期组中ORR高于标准组，OS更长。
早期组和标准组单采产品中，标准组中观察到Treg细胞百分比增加。两组CD4+和CD8+亚群中终末期T细胞百分比未观察到明显差异。此外，与早期组相比，标准组患者的T细胞耗竭特征更明显，T细胞功能降低。早期组和标准组患者CAR-T的转导率和体外效力(如IFN-γ分泌)方面无显著差异。
该研究表明，在早期采集而不是挽救治疗或后线治疗失败后进行淋巴细胞单采，T细胞数量和/或质量更好，产生更好的免疫应答。
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《单采越早越好？早期淋巴细胞采集用于CD19 CAR-T生产，可以改善弥漫大B细胞淋巴瘤患者的预后》
类似的，在另一项CD19/20 CAR-T细胞治疗DLBCL的研究中，对单采T细胞的分析结果显示，达到CR的持续应答(DR)患者的幼稚T细胞比例明显高于耐药(resistant)患者，而T_EFF细胞和T_CM细胞在耐药患者中的比例显著增加(图2)。同时，DR患者的单采T细胞在刺激后，表达的GZMB、IFN-γ和TNF-α水平高于耐药患者。CAR-T细胞的功能记忆表型差异存在于生产前的T细胞中(图3)，并且耐药患者中的CCR7+T细胞表现出记忆功能降低，激活和抑制剂相关基因TIGIT和LAG3的表达增加。
这些数据表明，CAR-T细胞产品之间的抗肿瘤功效差异存在于它们最初来源的T细胞中。收集来源更好的T细胞来制备CAR-T细胞(例如，在疾病诊断的早期阶段收集T细胞或细胞筛选)，有助于改善CAR-T细胞的功能并降低CAR-T治疗耐药性。
图2. DR和耐药患者单采T细胞的细胞群分析 (Source: Wang, Signal Transduct Target Ther, 2023. Fig 5a.)
图3. DR和耐药患者单采T细胞和CAR-T细胞的功能/分子差异特征 (Source: Wang, Signal Transduct Target Ther, 2023. Fig 6i.)
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《生产前CD8+T细胞的特征决定了CAR-T在弥漫大B细胞淋巴瘤中的疗效》
BCMA CAR-T细胞治疗MM的研究中，单采当天非PD患者(疗效为PR以上)外周血中CD8+T细胞明显多于CD4+T细胞；相比之下，疾病进展(PD)患者的CD4+和CD8+T细胞数量相当，以及Treg细胞的比例显著增加(图4)。这提示，单采当天外周血的不同细胞组成，可以鉴别出PD和非PD患者，为早期预测疗效提供了依据。
图4. 单采时非PD和PD患者外周血CD4+和CD8+ T细胞绝对计数以及Treg细胞比例 (Source: Fischer, Leukemia, 2024. Fig. 3A.)
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细胞水平
淋巴细胞计数
CAR-T细胞输注后，患者体内淋巴细胞增多主要来源于CAR-T细胞的扩增，这表明淋巴细胞计数可作为评估CAR-T扩增的替代指标。然而，淋巴细胞计数与有效性指标的关系在不同研究中结果并不完全一致，解读需谨慎。
与疗效的关系：
在一项分析比较两种BCMA CAR-T产品(cilta-cel和ide-cel)的研究中，在两种产品输注后+6至+7天后的绝对淋巴细胞计数(ALC)均有所增加，达到最大ALC(ALCmax)及其时间上有显著差异。
尽管BCMA CAR-T扩增是ALC升高的主要原因，但非CAR-T淋巴细胞也对ALC升高有所贡献，这提示内源性或非CAR-T淋巴细胞的扩增也起作用。
ALCmax与较高的VGPR或更好响应率相关，超过1000 /μL与较长的PFS及改进的DoR相关。因此，ALCmax是预测PFS和DoR的一个重要生物标志物，而患者的预处理方案和是否经历CRS或ICANS对PFS的影响不大。
BCMA CAR-T细胞的ALCmax和达到峰值的时间均高于CD19 CAR-T。在两类CAR-T细胞输注前，ALC没有差异。对于CD19 CAR-T治疗的患者，ALCmax与治疗后的最佳反应无相关性，且BCMA和CD19 CAR-T产品在ALC动力学方面存在差异，表明CAR-T后淋巴细胞增多可能受到疾病特异性特征的影响。
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在另一项CD19 CAR-T细胞治疗DLBCL的研究中，淋巴细胞计数却与PFS有关联。根据输注后第7天外周血淋巴细胞计数是否>1000/μL进行分组，发现第7天淋巴细胞计数>1000/μL患者的1年PFS显著高于第7天计数≤1000/μL的患者。
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与安全性的关系：
BCMA CAR-T细胞治疗MM的研究中，CRS的发生与患者较高的ALCmax相关。CRS的严重程度与ALCmax水平成正比。不同CAR-T产品(cilta-cel和ide-cel)在CRS发生时间和ALCmax水平上有差异。
ICANS的发生也与ALCmax升高有关。发生晚期神经毒性的患者有更高的ALCmax。
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CAR-T细胞的扩增和功能
理论上，CAR-T细胞的扩增与功能应该与临床上的有效性和安全性密切相关。然而，研究结果并不完全一致。
在一项CD19 CAR-T细胞治疗DLBCL的研究中，对比PD患者，DR患者的CAR-T细胞在体外实验中更有效地杀灭肿瘤细胞，并且分泌更多的TNFα和IFNγ，和CD107a表达更高。这提示细胞功能与疗效相关。
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在一项CD19 CAR-T细胞治疗淋巴瘤和CLL的研究中，较高的CAR-T细胞扩增峰值与临床OR相关。然而在另一项CD19 CAR-T细胞(Axi-cel)治疗LBCL的研究中，输注后较高的CAR-T细胞水平与疗效无关，但与CRS和ICANS的严重程度相关。
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然而，在MM中，情况有所不同。在一项BCMA CAR-T细胞治疗MM的研究中，CAR-T细胞输注数量与输注后的反应或体内扩增能力没有相关性。
在PD与非PD两组患者中，CAR-T细胞的体外杀灭肿瘤细胞功能相似，无疗效反应的患者的CAR-T细胞功能没有受到限制。但是，与非PD患者相比，PD患者在第7、14和30天的CD3+ CAR-T细胞数量显著减少。
发生CRS的患者CD3+CAR-T细胞比例均显著升高，但只有在未给予托珠单抗的患者中绝对细胞计数显著升高。这提示CAR-T细胞扩增伴随免疫激活导致IL-6增多，刺激T细胞扩增，未给予IL-6拮抗剂的话，这个过程会持续，引发和加重CRS。
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在接受BCMA CAR-T细胞治疗的MM患者身上，可能会发生罕见的延迟性神经毒性，在临床上与ICANS不同。这一并发症可能与外周血和脑脊液中异常高水平的CAR-T细胞有关，且与肿瘤组织外靶向效应(On-target off-tumor effects，简称脱靶效应)有关。这种脱靶效应依赖于BCMA蛋白在患者尾状核神经元和小胶质细胞上的表达。筛查时进行成像检查(如MRI)可能有助于了解是否存在预先存在的病变使患者易于出现延迟的神经并发症。此外，患者还表现出CAR-T细胞的异常持久，或许那些体内循环CAR-T细胞超过100天的患者风险更高，需要更密切地监测其神经系统症状。因此，及早进行MRI、脑脊液检查，并通过流式细胞术检测CAR-T细胞，或有助于及早发现延迟性神经毒性。
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CD8+CAR-T细胞
细胞药品(drug product，DP)、输注后外周血和MM骨髓中的CD8+CAR-T细胞研究主要与疗效相关。
在一项CD19 CAR-T细胞治疗DLBCL研究中，DR患者CAR-T细胞在体内的扩增主要由CD8+T细胞主导，通常在细胞输注后5天开始，并持续3-4周。
CAR-T细胞产品中，T_EM、T_CM和T_EFF含量在DR患者与PD患者之间没有差异，只有CD8+TSCM亚群的组成在应答患者中显著高于其他患者；大多数记忆相关基因(如CD27)在应答患者CD8+CAR-T细胞中的表达明显高于PD患者；此外，GZMK等激活和耗竭相关基因的表达显著下调。患者CD8+记忆CAR-T细胞中CCR7表达的减少、同时激活/抑制基因(如LAG3)表达的增加可能是治疗耐药的重要基因表达特征(图5)。
图5. DR和PD患者DP的分子/基因差异 (Source: Wang, Signal Transduct Target Ther, 2023. Fig 4e-h.)
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在另一项CD19 CAR-T细胞治疗DLBCL研究中，研究人员对Tisa-cel和Axi-cel DP和外周血进行分析，评估了CD8+ CAR-T亚群的相对比例与疗效之间关系(图6)。譬如，在使用Tisa-cel治疗的患者中，但不是Axi-cel，患者的疗效与D7 外周血中的CAR+细胞中CD8+亚型主要占比(>50%)相关；在Axi-cel中，D7 外周血中的CAR+T细胞的CD8+的比例在不同患者中是可变的，该值与DP中CD8+细胞的百分比高度相关；而Tisa-cel DP普遍由低于10%的CD8+细胞组成，但这些CD8+细胞在D7时显著扩增，特别是在有长期疗效的患者中。
图6. 使用不同产品的应答者和无应答者中T细胞的进化图谱 (Source: Haradhvala, Nat Med, 2022. Fig 3.)
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在一项BCMA CAR-T治疗MM研究中，PFS较短的患者骨髓中CD8+ CAR-T细胞和非CAR-T细胞在D28时表现出更高的裂解颗粒基因表达，与更多的终末效应分化一致。CAR-T细胞输注后3个月，在PFS较长患者的骨髓中，CD8+CAR-T细胞表达与骨髓保留/滞留相关的基因(如CXCR4和CD69)更高。
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另一项BCMA CAR-T治疗MM研究外周血有效性标志物中，CD3+ CAR-T细胞主要由CD8+ T细胞组成。然而，这种效应与反应无关，因为CD4+和CD8+ CAR-T细胞在PD患者和非PD患者中的纵向分布相似。PD患者的清淋似乎不如缓解者有效，在D0仍可以检测到更多的CD3+T细胞，特别是CD3+CD8+T细胞。
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有研究人员总结了几种细胞产品的CD8+ CAR-T细胞特征，发现含不同共刺激域CD28或4-1BB的CAR-T产品中CD8+成分与疗效的关系有差异。CD8+细胞分化和激活的总体程度似乎始终与基于4-1BB的CAR-T细胞产品的临床反应有关。4-1BB DP最初主要含CD4+CAR-T细胞。然而，CD8+CAR-T细胞在治疗后大大扩增，在应答者中扩增明显更大。CTLA4等检查点分子在无反应的DP和治疗后的CD8+CAR-T细胞中表达更强烈。无反应患者的DP具有更高的细胞毒性基因(如perforin)；接受细胞治疗的CLL应答者的DP富集了记忆基因特征。相比之下，基于CD28的CAR-T细胞产品没有如此清晰的趋势。
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CD4+CAR-T细胞
CD4+细胞毒性CAR-T细胞具有细胞毒性标记物特征性表达的特点，在表型上它们与CD8+T细胞高度相似，存在于DP和治疗后患者样本中，而在后者频率更高。在治疗早期出现这些极化到CD4+ CTL细胞可能预示不良效果，比如无临床响应的患者治疗后第7天中这种细胞比例增加。然而，在有的持续缓解CLL患者体内，细胞输注后5至10年间，主要持续存在的细胞为CD4+细胞毒性CAR-T细胞，并且保留了抗肿瘤活性而未耗竭。这些发现仍需要在更大样本中探讨。
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BCMA CAR-T治疗MM的研究中，PFS较短患者的CD4+ CAR-T细胞在D28时表现出更高的分化/效应表型，具有更高的IL32等基因表达。
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另一项BCMA CAR-T治疗MM的研究中，CD4+CAR-T幼稚细胞在作为对照组的髋关节置换受试者中富集，而骨髓瘤患者的CAR-T细胞和非CAR-T细胞在GZMB CD8+效应T细胞中富集。与非CAR-T细胞相比，无论是CD4+还是CD8+CAR-T细胞，与TCR克隆性都较低。与CD4+CAR-T细胞相比，CD8+CAR-T细胞的克隆性扩增更为显著。
如图7所示，患者分为两组：短暂应答者(TR)和持久应答者(DR)。在TR组中，第90天和第180天时CAR-T细胞减少了100倍以上，而DR组在第90天减少了不到1倍，在第180天减少了100倍以上。DR组中的CAR-T细胞富集CD8+效应记忆细胞。然后比较DR组和TR组中CD4+和CD8+CAR-T细胞的差异基因表达，发现在CD8+细胞中，只有HAVCR2基因(编码TIM3)在TR组中显著升高，TR组中的细胞毒性标志物为NKG7和PRF1，而在CD4+细胞中，HAVCR2和TIGIT均显著升高。
图7. 临床应答相关的CAR-T细胞特征 (Source: Ledergor, Blood Adv, 2024. Figure 3)
与DR患者相比，在TR患者输注后早期(14-30天)，CD4+细胞毒性耗竭基因评分高的细胞增多，为幼稚或效应记忆细胞，富含IFNG特征。而在DR和TR患者的CD8+这类细胞比例没有显著差异。
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CD4+CAR-T细胞中的调节性T细胞(CAR-Treg)与疗效和安全性的关系引起了人们的关注，其在不同疾病中的作用需要进一步探讨。
CD19 CAR-T治疗LBCL研究中，CAR-Treg在无应答患者中出现的比率增加。另一CD19 CAR-T治疗LBCL研究中也有一致的发现：CAR-Treg的早期扩增预示着临床进展和较轻的神经毒性，第7天血液中CAR-Treg的比例与CAR-T细胞的扩增呈负相关。然而，早期复发MM患者的DP中CAR-Tregs的比例并未增加。
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记忆CAR+T细胞
研究发现，细胞回输前，单采时或DP中的早期记忆T细胞与CAR-T细胞在体内扩增和持久性的改善有关。在接受CD19 CAR-T细胞治疗的CLL患者中，CD27+CD45RO-CD8+细胞与持续缓解相关。类似的CAR-T细胞群也存在于CD19 CAR-T细胞治疗的DLBCL患者中，与预后改善相关。早期记忆T细胞也与NHL和MM患者的应答相关，在无应答患者中T_EM比例更高。在一些成人DLBCL患者中观察到略有不同的模式，在对CAR-T细胞有应答的患者的DP中，T_EM/初始T细胞比例更高。
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CD19 CAR-T治疗LBCL研究中，Tisa-cel的DP主要由CM和EM表型的CD4+细胞混合组成，与应答患者相比，无应答患者的CMs略有升高。在D7，两种CD19 CAR-T产品的CMs主要被EMs取代，与疗效反应无关。Tisa-cel应答患者有更多表达CM标记CCR7和LEF1的细胞，并表达转录因子STAT1；无应答患者在EM1簇中的细胞数量更高。
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BCMA CAR-T细胞治疗MM的研究中，尽管单采当天的PBMCs仍含有约10.15% 初始 CD4+ T细胞，但在CAR-T细胞输注后几乎整个群体都表现出中枢记忆或效应记忆表型。
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CD8+non-CAR-T细胞
BCMA CAR-T细胞治疗MM的研究中，PFS较短的患者非CAR CD8+ T细胞在D28时表现出更高的裂解颗粒基因表达，与更多的终末效应分化一致。另一项研究中，在有疗效的患者中，CAR-T细胞输注后7天和14天，CD8+ CAR阳性T细胞的百分比接近于CD8+CAR阴性T细胞；而PD患者CD8+CAR阴性T细胞在所有时间点都占主导地位。
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CD4/8比值
CD19 CAR-T细胞治疗DLBCL的研究中，经历治疗线数少的患者比治疗多的疗效更好，前者DP中(非CAR+)CD4/CD8比值更低，后者中(非CAR+)CD4+/CD8+T 初始细胞的百分比显著低于前者。
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单采产品中的CD4/8的比例选择会引起ALL患者的CD22 CAR-T细胞的扩增以及治疗后炎症反应的增加。尽管CD4/8细胞的理想比例尚未明确，并且有可能因不同的患者个体而有差异，但这些指标依旧是表征CAR-T DP的重要组成部分。
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另一项CD19 CAR-T细胞治疗ALL研究结果却提示，DP中的CAR+ CD4:CD8比率与应答无关，患者间临床应答的差异可能更多地与扩增潜力有关，而不是原始数量。
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双阴性CAR-T细胞
CD19 CAR-T细胞治疗B-ALL研究中，CAR-T细胞在输注后多年仍具有增殖能力。在大多数情况下，CD8+T细胞是主要的CAR-T细胞，在晚期(治疗第7-60个月)时间点会出现CD4和CD8A转录本的缺失，主要是双阴性T细胞。在晚期时间点，非CAR-T细胞中双阴性T细胞的比例较低。同时，CAR-T细胞缺乏CD45RA和CCR7的表达，呈现效应记忆表型。在持续存在的CAR-T细胞中，大部分为双阴性αβT细胞，而早期(治疗第1-3个月)CAR-T细胞主要是CD8+T细胞。早期CAR-T细胞中的一部分是γδT细胞，与CD8 T细胞和NK细胞类似。
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有研究发现，在较晚的时间点，仍可检测到数量很少的CAR-T细胞，主要为CD4/CD8双阴性细胞，但这些细胞的功能尚未完全阐明，它们是否在维持长期缓解中发挥积极作用，或者是显示肿瘤清除治疗已经完成的残留物。这些细胞具有细胞毒性表型，表达一些与耗竭相关的转录因子，但同时保留了增殖细胞群。
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CD3+T细胞
CD3+细胞是临床较为容易监测的标志物。有研究利用这个指标来分析其与疗效的关系。
CD19 CAR-T细胞治疗DLBCL的研究中，依据患者单采时CD3+细胞计数，将患者分为CD3+LOW组和CD3+HIGH组。结果显示，CD3+HIGH组的1年PFS显著高于CD3+LOW组，同时，CD3+HIGH组的OS也更长。
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耗竭型T细胞
T细胞耗竭对预测结果很重要，包含影响细胞分泌细胞因子、杀伤靶细胞和增殖能力的终末分化状态。T细胞耗竭的特征是抑制标志物如PD-1、PD-L1、TIM3和LAG3的表达。耗竭细胞比例高，预示着DLBCL患者对CAR-T细胞治疗的反应效果不佳。在另一项关于T细胞耗竭的研究中，原发性CAR-T细胞治疗失败的患者DP中的CD57+CD39+CD28-细胞毒性CD8+ T细胞的比例较高。与健康对照相比，TIM3与其他几种衰竭标志物(包括PD-1和LAG-3)在淋巴瘤患者的CAR-T细胞中也更常见。
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然而，有研究显示CD8+ T细胞的类似耗竭表型状态与肿瘤反应性和临床获益相关。重建人类免疫系统组分的小鼠模型中，具有激活且耗竭样表型的人效应CD8+ T细胞可在体内控制肿瘤生长。
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在解析T细胞耗竭的层级过程和白介素-10(IL-10)对耗竭T细胞的作用中，一个假说是(图8)，IL-10直接作用于T_INT-EX和T_EFF-EX，促进它们的扩增和效应活性；还可通过其他方法(“转移”)，例如通过调节表观遗传印记来预防耗竭的表现，以促进功能性抗肿瘤T细胞的分化。开发先进的工程方法，将慢性刺激的T细胞从耗竭程序中转移出来，或驱动自然或合成T细胞状态，使其既保持细胞毒性又保持持久性。
图8. 慢性激活下的T细胞分化层级图 (Source: Heuser-Loy, Cancer Commun (Lond), 2024. Figure 1.) 箭头宽度表示细胞密度，箭头长度表示分化速度. T_N，初始T细胞；T_CM，中心记忆T细胞；T_EM，效应记忆T细胞；T_EFF，效应T细胞；T_ST(short-term)-PEX，短期前体耗竭T细胞；T_LT(long-term)-PEX，长期前体耗竭T细胞。
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B细胞
CAR-T 细胞输注后B细胞的变化特征在肿瘤领域和AID领域均有预测意义和治疗机制的发现。
对接受CD19 CAR-T治疗的B-ALL患者来说，BCA情况的监测可能是一种有价值的复发预测方法。B细胞再障是CAR-T持续性的标志，相反，CD19 CAR-T细胞治疗后过早发生B细胞恢复与复发风险增加有关。
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CD19 CAR-T细胞治疗AID的研究中，基于CD19 CAR-T细胞的疗法可在不影响其他免疫细胞亚群组成或T细胞反应本质的情况下，选择性地重置B细胞库。这些记忆B细胞即使在其他B细胞亚群随CD19 CAR-T细胞治疗后重新出现的情况下，也未重新出现在外周血中。而在CD20抗体介导的B细胞清除治疗后，记忆B细胞持续存在或重新出现，这与治疗失效和疾病复发相关。这一发现可解释CAR-T细胞疗法的临床效果。未来，直接评估不同B细胞清除策略(如CD19 CAR-T细胞与抗CD20抗体)后重置B细胞的分子特征差异将至关重要。
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另一项CD19 CAR-T细胞治疗AID的研究中，研究人员对患者腹股沟淋巴结活检中B细胞滤泡区域的研究结果显示，这些B细胞靠近滤泡树突细胞(follicular dendritic cells，FDCs)和滤泡辅助T细胞(follicular T helper cells，TFH)。CD19 CAR-T细胞治疗后的患者淋巴结中CD19+和CD20+ B细胞完全被清除(图9)。虽然在CD19 CAR-T细胞状态前结构正常，但在细胞治疗后，B细胞成熟区室不复存在，包括FDC网和TFH细胞的消失以及增殖率的降低(<90%)。CD19-CAR-T细胞可完全清除组织中的B细胞，并伴随着淋巴结中FDCs和滤泡结构的消失。
图9. CD19-CAR T细胞治疗前后外周血和淋巴结的变化 (Source: Tur, Ann Rheum Dis, 2024. Figure 1.)
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髓系细胞和树突状细胞
BCMA CAR-T细胞治疗MM的研究中，与PFS较短(<6个月)的患者相比，PFS较长(>6个月)的患者在D28时骨髓中髓系细胞(myeloid cells)的比例较低。PFS较短的患者在D28时单核细胞/巨噬细胞标志物(如CD14和CD11b)增加。DCs标志物(如CLEC9A和CD1c)在PFS较长的患者中富集，特别是在治疗后第3个月。
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分子水平
TCR
CD19 CAR-T细胞治疗B-ALL研究中，研究人员对持续存在的CAR-T细胞，进行TCR序列的交叉查寻。结果发现，绝大多数跨时间点的细胞都具有独特的克隆型，这表明持续存在的CAR-T细胞群体存在丰富的多样性。不同克隆型之间的细胞类型构成存在差异，不同时间点观察到一致的克隆型主要是CD8+T细胞，而独特的克隆型往往是双阴性T细胞。对部分患者的追踪数据显示，CAR-T细胞群具有从CAR-T细胞产品至2年和5年持久的遗传多样性。这些发现表明CAR-T细胞功能的持久性不是由单一克隆的扩增所驱动。
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经BCMA CAR-T治疗的MM患者的骨髓中，CAR-T细胞输注后，TCR多样性在D28时增加。在PFS较短的患者输注前TCR多样性较低。
往期推送：
CRP和铁蛋白
患者体内的CRP和铁蛋白可预测CAR-T细胞产品的疗效和安全性。
CD19治疗DLBCL的研究中，基线CRP和铁蛋白升高与较低缓解率相关。同时，研究人员建立了风险分层模型并进行外部验证，结果显示CRP和铁蛋白水平与风险显著相关：
低危组(CRP<4mg/dL且铁蛋白<400ng/mL)
中危组(不符合高危或低危标准)
高危组(CRP>4mg/dL且铁蛋白>400ng/mL)
高危组中有7名患者(26%)出现重度CRS，而中危组和低危组分别为6名和1名。
重度ICANS的发生率在高、中和低危组中分别为52%、30%和16%。
高危组的中位OS为6.9个月，而中危组为14.9个月，低危组未达到中位OS。
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在一项BCMA CAR-T细胞治疗MM的研究中，多变量分析显示，清淋时铁蛋白升高与较差的OS相关。
往期推送：
另一项BCMA CAR-T细胞治疗MM的研究中，大多数患者在输注后不久CRP急剧升高(非感染)，非PD患者增加更为显著；与没有CRS的患者相比，CRS患者的最大CRP水平更高。
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转录特征
持续存在的CD19 CAR-T细胞的转录特征：在输注后的各个时间点，CAR-T细胞逐渐分化，偏向于GZMH和GZMB表达较高或GZMK表达较高的细胞群；前者还表达FGFBP2和ZEB2，而后者表达与效应(LTB)、记忆(CD27和IL7R)以及激活(CD28)功能相关的基因。
晚期CAR-T细胞表达共抑制受体HAVCR2和LAG3，但PDCD1的表达较小。虽然表现出耗竭特征，但晚期CAR-T细胞并未出现终末分化(CD57)。与DP中的CAR-T细胞不同，晚期CAR-T细胞不表达高水平的TCF7，而JUN稳定表达(T细胞耗竭的逆转和具有干细胞记忆特性的细胞的维持)。
上述CAR-T细胞的持久性特征在其它生物学基质(包括正常外周血、人胎儿骨髓、人胎儿胸腺和多种癌症)中并未发现。
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ctDNA
在B-NHL患者接受CAR-T治疗后，基于无创性ctDNA的肿瘤基因分型有助于解析高风险基因和CAR-T疗法抗性的基因组。用于监测MRD的最常用的ctDNA技术包括PCR和NGS。ctDNA可作为PET/CT评估的互补分析物，能够间接测量代谢活性肿瘤。此外，同时进行ctDNA评估有助于解读PET/CT影像。CAR-T治疗后通过ctDNA监测可以比传统的PET/CT成像更早地检测到B-NHL各亚型中的疾病复发。
在单采时进行循环游离DNA(cfDNA)评估，可能有助于识别出接受CAR-T治疗后预后不良的高危人群。初步发现提示，淋巴清除前ctDNA阈值>100 Lg/mL，或能有效识别CAR-T治疗后复发风险高的LBCL患者。治疗后的ctDNA动力学变化和MRD评估代表了潜在的生存替代指标。分子反应不佳或MRD阳性的患者提示复发风险较高，以检测早期进展。
目前关于ctDNA在CAR-T的应用研究仍处于初级阶段，试验方法之间存在着显著的异质性，需要标准化去中心化的预分析处理过程；将ctDNA融入临床决策仍存在不确定性。即使ctDNA在B-NHL中获得临床应用批准，测试的可负担性和可获取性仍然是主要关注点。
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DNA甲基化
研究发现CAR-T细胞的培养过程中，DNA甲基化模式发生持续变化，体现在CpG位点的差异。这些CpG位点分别与白细胞和T细胞活化和分化相关联。
阻断与培养相关的甲基化重塑可能改善CAR-T细胞功能。培养相关的甲基化变化与输注后CAR-T细胞的耗竭相关，培养过程中的甲基化可能反映CAR-T细胞的耗竭状态和衰老过程。制造过程中缩短细胞培养时间可能是有益的，需要通过临床试验来证实。
另外，与培养时间相关的DNA甲基化特征可以作为CAR-T细胞的生产质量控制和预测不良反应的生物标志物。有研究发现了一组与培养时间相关的高甲基化和低甲基化的CpGs。这些CpGs作为培养时间的预测因子，显示出与CRS和ICANS的相关性，还与死亡率和OS相关。
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自体反应组
有研究发现，每个个体都有一个独特且高度可重复的自体反应性集合，称之为“自体反应组(autoreactome)”。个体的自体反应组一旦形成，经过多年的时间保持变化极小。靶向BCMA的疗法显著改变了个体的自体反应组，而针对CD19和CD20的疗法则几乎没有影响。这些数据不仅确认了自体反应组主要由浆细胞分泌的自体抗体组成，还强烈提示，BCMA或其他靶向浆细胞的疗法可能在治疗目前难治的自体抗体介导的疾病中非常有效。
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肿瘤特异性表征
在CD19 CAR-T细胞治疗淋巴瘤的研究中，由滤泡性淋巴瘤转化为DLBCL的患者其生存率更高。淋巴瘤中存在p53突变或TP53突变ctDNA水平较高的患者，对CAR-T细胞治疗应答较差。CAR-T细胞输注前肿瘤样本中CD58的缺失会导致疗效不佳。
有和没有高危细胞突变的白血病患者之间，未观察到CAR-T细胞治疗后疾病缓解或OS存在差异。尽管KMT2A与较高的复发风险无关，但有KMT2A重排的患者在CAR-T细胞治疗后复发时更有可能发生系别转化。
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其他
BCMA CAR-T治疗的MM患者的 BM 中，PFS较长患者的肿瘤成熟浆细胞基因(如syndecan-1/SDC1、BCMA/ TNFRSF17和XBP1)和干扰素应答基因的表达较高，而PFS较短的患者中较不成熟的B细胞相关基因(如PBXIP)的表达较高，与分化程度较低的表型一致)。DEGs通路分析显示，PFS较短的患者中上皮-间质转化通路富集。
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对细胞因子谱、凝血障碍、骨髓功能障碍和血细胞减少症和肠道微生物组的研究，也为预测和监测CAR-T细胞治疗的有效性和安全性提供参考。
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抗原逃逸/丢失
CD19 CAR-T细胞治疗儿童B-ALL研究中，18例复发患儿中有7例在CAR-T细胞输注1个月后出现细胞表面CD19表达缺失，其中1例复发甚至出现AML的谱系转换。因此，在输注后1个月内测定抗原表达水平和MRD状态可能有助于预测对CAR-T细胞疗法的应答。
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BCMA CAR-T细胞治疗MM研究中，血清sBCMA水平的评估显示，与应答者相比，PD患者在单采、输注后第30天和第100天的值显著更高。但PD和非PD患者中均未观察到BCMA表达的丢失。
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在BCMA CAR-T细胞疗法中基因改变导致抗原丢失而发生耐药并不常见，而在一项GPRC5D CAR-T细胞治疗MM的研究中，结构染色体改变可以导致患者GPRC5D双等位基因丢失，从而介导耐药。所有复发的患者在疾病进展时，均显示出降低或缺失的GPRC5D mRNA转录水平和蛋白表达。
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临床观察或发现转化为临床前实验
临床观察或发现还可转化为临床前实验以探索机制和新型治疗方法。
CD19 CAR-T治疗LBCL研究中，研究人员针对CAR-Treg是否削弱CAR-T疗效的临床问题，返回到实验室进行验证。他们从健康供体的外周血中分离出了大量的CD3+常规T细胞(Tconv)、Treg和CD4+T细胞，并用CD19 CAR转导这些细胞。在体外实验中，与CAR-CD4对照组相比，25%的CAR-Treg细胞显著减少了CAR-Tconv的扩增，且足以导致肿瘤复发。紧接着由95% CAR-Tconv和5% CAR-CD4或5% CAR-Treg细胞组成的CAR-T细胞，注射NSG荷瘤小鼠。第3天所有小鼠的早期肿瘤明显地被清除，但延长观察期后，所有给予CAR-Treg小鼠出现明显复发，而对照组小鼠没有复发(图10)。
图10. CAR-Treg细胞介导小鼠复发和体内验证实验 (Source: Haradhvala, Nat Med, 2022.Figure 5e–g.)
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在实体瘤中，CAR-T细胞疗法缺乏显著效果的部分原因，与高肿瘤负荷相关的全身性炎症、免疫失调和不利的TME之间相互作用相关。通过合理的治疗组合或能逆转局部TME的免疫抑制效应。例如，在肝细胞癌小鼠模型中，添加索拉非尼可以增加肝细胞癌细胞凋亡并诱导肿瘤内巨噬细胞产生IL-12，从而增强CAR-T细胞治疗的效果。
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技术相关
关于单细胞技术在CAR-T细胞治疗中的应用
近几年，单细胞技术在准确性、可拓展性和价格上均取得了改善，可以用于支持开发更有效的CAR-T细胞。前述的多个生物标志物的研究，如鉴定最适合用于CAR-T生产的T细胞群，结合了单细胞多组学工具；在开发和设计阶段引入基因组方法，可用于鉴定动物模型的抗原表达、靶点识别、共刺激域设计、体外功能试验及动物模型体内疗效。
在临床阶段，鉴于不同患者和肿瘤类型在CAR-T治疗中存在差异，单细胞工具可以识别患者治疗前后的免疫状态、与治疗应答相关的CAR-T、肿瘤和TME分子标记，以及区分患者特征，识别有望从CAR-T治疗中获益最大的患者，能够揭示驱动CAR-T相关毒性的多种分子机制。
单细胞多组学技术作为同种异体CAR-T细胞开发的宝贵工具，可以提供患者应答的标准化和全面的转录组学图谱，更重要的是，提供患者之间应答的差异，从而支持"通用"CAR-T的临床应用。此外，单细胞基因组学还可以用于检查免疫系统是否发生GvHD和移植排斥。
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解释scRNA-seq数据的挑战
少数个体的重复细胞测量可能导致假阳性结果。此外，由于scRNA研究的样本量通常较小，运行所有可能的测试并计算多重假设校正将会完全消除研究的统计学把握度；在实践中探索性分析哪些细胞类型具有与目标变量相关的信号不可避免地会改变检验哪些假设的决定。然而，这将以在多重假设检验框架中增加检验的错误发现率。正因如此，单细胞数据最好用于假设生成，并通过验证实验进行随访，以更严格地检验该发现。
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多组学动态分析技术
由于肿瘤间和肿瘤内的异质性，现有的生物学技术难以准确捕捉具有特定和期望特征的DP的复杂性。例如，单个较少分化的细胞(如中枢记忆或干记忆T细胞)在持续性和功能潜力上存在差异。有临床前数据表明，细胞在TME中重新获得效应功能的能力是肿瘤清除的关键特征。scRNA-seq无法直接检测细胞的功能以及其与肿瘤细胞的相互作用。因此，整合功能和分子特征的分析将揭示具有最佳抗肿瘤功能的T细胞的分子特征。
CD19 CAR-T细胞治疗的DLBCL患者中，多组学动态分析技术——时间延迟成像显微镜(TIMING)、共聚焦显微镜和单细胞RNA测序——可在单细胞水平上进行检测，从而探究DP中的T细胞的迁移、杀伤和细胞器体积之间的关系；3D堆叠图像可捕捉线粒体体积(增殖能力特征)、溶酶体体积(含有穿孔素/颗粒酶的分泌性溶酶体)和细胞核体积(反映细胞大小)。结果显示，与PR或PD个体的T细胞相比，CR个体的T细胞具有较大的线粒体和溶酶体体积；迁移能力与线粒体体积呈线性相关，与溶酶体体积也呈线性相关(图11)。这些数据表明，CR个体的DP T细胞比PR或PD个体的T细胞在迁移、杀伤和线粒体健康方面表现更优。
图11. 与PR/PD患者的T细胞相比，CR患者的T细胞的迁移、连续杀伤能力更强 (Rezvan, Nat Cancer, 2024. Figure 2.)
通过整合功能、表型、转录分析和代谢，在体外实验中鉴定并验证了一群与临床反应相关的CD8+ T细胞，命名为CD8-fit T细胞；这些细胞可通过简单的穿膜迁移实验富集。
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结语
在肿瘤领域，尤其是B细胞恶性肿瘤和MM，转化医学通过研究内源性自体CAR-T细胞异质性和患者体内生化指标，已验证了多种细胞特征及分子标志，可预测CAR-T细胞在临床应用中的有效性和安全性，并监测肿瘤复发、抗原逃逸和非肿瘤靶向毒性。同时，转化医学研究发现为提高CAR-T细胞质量和降低CAR-T细胞治疗成本提供了可行的方法参考，包括尽早采集外周血作为CAR-T DP的原材料和缩短制备时间。然而，在某些难题中仍有待进一步探索，比如提高治疗T细胞恶性肿瘤、AML和实体瘤的疗效，以及克服TME对CAR-T细胞功能抑制。
在AID领域，转化医学已为阐明CAR-T细胞治疗机制做出贡献。由于CAR-T细胞治疗AID仍处于早期阶段，关于该疗法的影响、安全性和长期有效性仍需要进一步研究来确认。
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《Georg Schett/Fabian Muller/Carl June联合综述|CAR-T细胞治疗自身免疫性疾病的进展和挑战》
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