撰文：wokasy | 编辑：戴戴
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2024年6月来自于伦敦大学学院的Mark W. Lowdell团队在《Journal for ImmunoTherapy of Cancer》上报道了肿瘤记忆型NK细胞的蛋白质组学以及表型特征，文章标题为“Proteomic and phenotypic characteristic of memory-like natural killing cells for cancer immunotherapy”。“细胞知聊”本期为您带来相关内容介绍。
在本研究中，作者用细胞因子启动（细胞因子诱导记忆样（iCIML）-NK）和肿瘤启动（TpNK）的方式，使健康供体体外启动记忆样NK细胞（mlNK），并通过高维流式细胞术、蛋白质组学和代谢组学分析对它们进行了比较。为理解增强细胞杀伤功能的潜在机制，作者还利用z-Movi技术分析了mlNK与NK抗性肿瘤的结合亲和力cell avidity。作者从健康供体和癌症患者中生成TpNK，以确定通过与单一肿瘤类型相互作用生成的mlNK是否可以增强杀伤活性。最后，作者还使用复制缺陷型肿瘤细胞系（INKmune）治疗患有髓系白血病的患者，以增强体内NK细胞功能。最终结果显示不同来源的mlNK具有共同的表型簇、蛋白质组学变化和代谢功能。作者最后得出结论，NK细胞“记忆”是一种生理状态，与抵抗MHC介导的抑制、增强的代谢功能、线粒体适应性和对NK抗性靶细胞的亲和力有关。
结果
肿瘤-mlNK和细胞因子-mlNK表现出独特的表型元簇
▲图1: 肿瘤-mlNK和细胞因子-mlNK的表型及表型元簇特征。A）光谱流式细胞术分析不同NK细胞标记物表达并使用viSNE分析结果。B）不同条件NK种每个元簇的细胞数量百分比变化。C）热图显示元簇1-10的指示标记上细胞总数的荧光强度。
元簇8在静息NK（rNK）和NK+IL15中出现的频率非常低，但可检测到，并在记忆样群体中扩增，这表明mlNK可能是体内生理正常的亚群。mlNK细胞表现出独特的蛋白质组学特征，其特征是线粒体存活蛋白的上调。为了进一步表征不同类型的mlNK细胞，作者接下来探索了蛋白质组学谱，比较了iCIML-NK、TpNK和NK+IL15与直接分离的rNK。
▲图2: 肿瘤-mlNK和细胞因子-mlNK的蛋白质组学特征以及代谢呼吸特征。A）与仅在培养基中培养的NK细胞相比显著（p<0.001）上调了4个对数以上蛋白数目维恩图。B）线粒体存活蛋白在不同组中的平均对数比率。C）不同组NK的糖酵解功能。D）不同组NK的线粒体呼吸功能。
健康捐献者和肿瘤患者启动的NK对NK抗性的血液瘤和实体瘤细胞都具有杀伤性
NK细胞记忆的标志之一是这些细胞在第二次接触靶标时会增强细胞毒性。因此，作者验证了来源于健康捐献者（HD）以及肿瘤患者启动（Primed）的TpNK的细胞毒性功能。用INB16细胞（研究NK记忆的常用模式细胞）引发的HD-NK细胞在体外表现出对血液系统癌症（Raji、U266、MDS-L）、肾细胞癌（786O和ACHN）和卵巢癌（SKOV3）肿瘤细胞系的杀伤增强，同时CD69、CD107a、TNF-α及IFN-γ快速上调。作者又分别从卵巢癌患者、透明细胞肾细胞癌患者和骨髓增生异常综合症（MDS）患者中分离NK，在静息和用INB16启动后考察NK抗性肿瘤的功能，发现INB16启动的TpNK对NK抗性靶细胞的杀伤功能显著增强。
▲图3: 健康捐赠者和癌症患者的肿瘤引发NK细胞可裂解血液和实体肿瘤细胞。A）健康捐赠者的TpNK细胞对肿瘤细胞的毒性作用。B）健康捐赠者的TpNK细胞中不同标志物的表面和细胞内表达。C）癌症患者的TpNK细胞对肿瘤细胞的毒性作用。D）利用z-Movi技术测量不同NK细胞与Raji细胞共孵育10min时的细胞亲合力。E）不同NK细胞与SKOV3细胞共孵育10min时的细胞亲合力。F）不同孵育时间点不同NK细胞与Raji细胞的亲合力。G）将Raji结合的亲和力与杀伤功能进行比较。
INKmune疗法在MDS和AML患者体内产生具有免疫记忆特征的NK细胞
为了验证TpNK在肿瘤患者体内的情况，作者将来自半相合供体的同种异体NK细胞与INB16细胞裂解物一起孵育，激活NK细胞。之后，NK细胞被冷冻保存、运输并在完成清淋化疗1天后注入患者体内（称为INKmune疗法）。这是首次试验不需要细胞因子支持的过继NK细胞疗法。
两项试验共治疗了19名患者，其中一名化疗耐药性AML患者获得CR，并维持超过11个月，三名患者获得CR，两名患者在32.6至47.6个月内未复发。作者想进一步激活NK细胞功能有缺陷的AML/MDS患者的内源性NK细胞，来检测是否可增强其活性并改善总体生存率。结果显示，在一名晚期三系MDS患者和两名难治性AML患者体内活化NK细胞频率均增加。治疗后，三名患者对Raji的杀伤活性均有所增强，证实了NK细胞活化率有所提高，甚至在治疗后140天依旧能检测到活化的NK细胞。患者NK细胞表型分析显示CD57和CD2的表达强度增加，这与之前在体外观察到的TpNK细胞产生的效果相符。此外，还观察到虽然最初两名患者的NK细胞未携带颗粒酶B，但在治疗之后，其颗粒酶B的表达水平有明显的提升。众所周知，MDS患者的NK细胞缺乏杀伤机制，在这里我们观察到这种功能障碍可以通过INKmune治疗逆转。
▲图4: INKmune在患有骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病的患者体内产生类似记忆的NK细胞。A）所示日期每位患者的CD69+NK细胞百分比。所示日期患者NK细胞介导的(B)Raji和(C)K562特异性裂解百分比。直方图显示所示日期CD57、CD2和颗粒酶B的表达百分比。热图表示阳性群体的平均荧光强度，归一化为患者(D) MDS#01和(E)AML#01的每列的最低值。
综上所述，“NK细胞记忆”的概念已经得到充分证实，并且具有记忆功能的NK细胞可以通过多种机制获得。记忆样NK细胞已在CMV和CIML-NK细胞的背景下得到广泛研究，但mlNK细胞可以从肿瘤启动中产生的想法仍然研究得很少。在这里，作者描述了由多细胞因子刺激和肿瘤介导的启动产生的记忆样NK(mlNK)细胞的启动的共同点。这些mlNK细胞具有共同的表型簇、蛋白质组学变化和代谢功能。这项研究还表明，在体外来自于健康供者和癌症患者的NK细胞通过INB16启动都可以获得mlNK的表型，甚至肿瘤-mlNK细胞可以在血液系统恶性肿瘤患者的体内产生疗效。通过该项研究我们对肿瘤-mlNK的特性有了更深入的理解，为将来作为癌症治疗的手段有了更进一步的推动。
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