撰文：阿嫣 | 编辑：珊珊
自然杀伤(NK)细胞疗法是一种有吸引力且安全的抗癌治疗策略。然而，当单独使用自体或异体NK细胞时，临床疗效并不理想。
当NK细胞结合治疗性单克隆抗体时，可以通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)机制增强其抗肿瘤活性。然而，单抗治疗需高剂量，可能带来副作用。因此，使用体外扩增的供体来源NK细胞与单克隆抗体结合的策略显示出了前景。
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《CAR-NK细胞使用CD28共刺激域是否合理？》
此外，嵌合抗原受体(CAR)-NK细胞可进一步提高靶向特异性，但是复杂的制造过程限制了其广泛应用。因此医学研究人员想到开发一种无需进行细胞遗传修饰的靶向NK细胞疗法。
2024年7月，澳大利亚黑色素瘤研究所的Loïs Coënon等学者在《Journal for ImmunoTherapy of Cancer》期刊上发表了题为“Generation of non-genetically modified, CAR-like, NK cells”的研究论文。
该研究中，通过设计的工程化抗体(Pin-mAbs)与NK细胞自然表达的CD16a结合，不改变基因组即可增强NK细胞抗肿瘤能力。这种方法简化了制造过程，因此易于接受和推广应用。此外，该技术还可以通过使用多种Pin-mAbs针对不同抗原来解决肿瘤细胞异质性问题，提高治疗效果。
具体而言，这项研究展示了体外扩增的NK细胞(eNK)被Pin-CD20抗体武装后形成的稳定复合体，不仅能够在体内外保持结构稳定，还能对B-淋巴瘤细胞系引发抗体依赖性的细胞毒性反应。Pin-CD20 eNK细胞不仅在体外显示出长期增强的细胞毒性，在体内也能有效地清除CD20阳性肿瘤细胞。此外，双重抗体武装进一步提升了治疗潜力。“细胞知聊”本期为您带来相关内容介绍。
研究内容
eNK被Pin-CD20武装，形成的复合体在体内外均保持稳定
科研人员将IgG1 CH2结构域中的氨基酸替换呈S239D/H268F/S324T/I332E，这极大地增加了对CD16a的亲和力(>30倍)，且减少了不同CD16a变异体之间的亲和力差异，还强化了ADCC机制。因此，Coënon等人通过在这四个位点对利妥昔单抗进行突变，制备了一种改良的抗CD20抗体，即Pin-CD20。
实验显示，eNK细胞与Pin-CD20共孵育后，立即有80%以上eNK细胞被武装，72小时后仍保持50%以上的武装率(图1E、F)。体内实验中，Pin-CD20 eNK细胞在严重联合免疫缺陷小鼠(SCID小鼠)体内24小时后仍有80%维持武装状态(图1G)。表明Pin-CD20 eNK复合体能在体内外稳定存在。
图1E、F, eNK和Pin-CD20 eNK在72小时动力学中的武装效率比较。图1G，在SCID小鼠腹腔注射后24小时评估Pin-CD20 eNK细胞的武装效率。
此外，Coënon等评估了人IgGs或表达Fcγ受体的其他细胞类型是否会影响Pin-mAb与eNK细胞的结合。
通过将Pin-CD20 eNK细胞与人IgG共孵育或与外周血单核细胞(PBMCs)共孵育发现，即使在人IgG存在的情况下，Pin-CD20 eNK细胞仍保持稳定，表明Pin-mAb的结合不易受到置换的影响。
结果还显示，巨噬细胞和单核细胞可以被Pin-CD20武装，诱导对CD20阳性靶细胞的吞噬作用，表明Pin技术也可应用于巨噬细胞等其他Fcγ受体表达的细胞类型，显示出该技术的广泛适用性。
Pin-CD20 eNK在体外对B-淋巴瘤细胞系诱导Pin-mAb依赖性的细胞毒性(Pin-ADCC)
传统ADCC由CD16a+ NK细胞遇到IgG包被的靶细胞后形成免疫突触并引发细胞毒性。在Coënon等研究的设置中，Pin-mAb eNK细胞已经与抗体结合，形成免疫突触的不同顺序是否仍然会诱导mAb特异性细胞靶向和细胞毒性，这一点仍不清楚。
Coënon等人比较了Pin-CD20 eNK与eNK细胞的细胞毒性和活化情况(图2A)。
图2A，用于评估Pin-CD20 eNK细胞的体外功能分析概述。
实验显示，Pin-CD20 eNK细胞对12种不同CD20表达水平的癌细胞系均具有显著细胞毒性，且不受CD20表达量影响，表明少量抗原即可引发细胞毒性。与未武装eNK细胞相比，Pin-CD20 eNK细胞对高表达和低表达CD20的细胞系均有更强细胞毒性。
通过使用不同浓度的Pin-CD20武装eNK细胞，发现10 µg/mL是最佳武装浓度，低于此浓度也能产生强大细胞毒性。表明Pin-CD20 eNK细胞的细胞毒性与武装浓度有关，但超过一定浓度后不再增加。
此外，Pin-CD20 eNK细胞仅在存在CD20表达的靶细胞时才激活，表现为CD107a表达增加及更多TNF-α和IFN-γ分泌，但未激活补体系统(图2F、2G)。
图2F，流式细胞术检测Daudi细胞存在或不存在时eNK或或Pin-CD20 eNK上CD107a的表达情况。图2G，Daudi细胞存在或不存在时，eNK或Pin-CD20 eNK分泌的细胞因子或颗粒毒素水平。
这些结果表明Pin-CD20 eNK细胞能够特异性地对表达CD20的靶细胞产生有效的细胞毒性，为癌症治疗提供了一种潜在的策略。
Pin-CD20 eNK展示出长期增强的细胞毒性
鉴于Pin-CD20在eNK细胞上的结合持久(图1F)，Coënon等人评估了Pin-CD20 eNK细胞的功能活性。结果显示，这些细胞在武装后几天内仍保持高水平的细胞毒性，表明它们具有长期增强的细胞毒性能力(图3A)。即使未经细胞因子刺激，Pin-CD20 eNK细胞在2天后仍保持高度细胞毒性，尽管效能有所下降(图3B)。
图3A，流式细胞术检测E:T比为10:1时靶细胞死亡情况。图3B，eNK和Pin-CD20 eNK细胞毒性。
研究还发现，尽管CD16a V158纯合子(V/V)多态性倾向于更稳定地维持武装，但不同多态性组别间的细胞毒性无显著差异，表明Pin-ADCC不受CD16a多态性影响。
实验结果表明，Pin-CD20 eNK细胞在接触靶细胞24小时后仍能有效杀死新加入的靶细胞，尽管武装程度有所下降。因此，建议在治疗中采取多次给药策略。
这些结果表明，Pin-CD20 eNK细胞能够在较长的时间内保持其细胞毒性，这意味着它们对于靶细胞的杀伤能力持久有效。
Pin-CD20 eNK在动物体内有效地清除CD20阳性的靶细胞
Pin-CD20 eNK细胞在体内消除CD20阳性B细胞的第一个概念验证是在人源化的NCG小鼠模型(一种高度免疫缺陷的小鼠模型)中进行的。在该模型中，Pin-CD20 eNK杀死50%的B细胞，而对T细胞没有影响(图4B)。
图4B，将eNK或Pin-CD20 eNK静脉注射到CD34+重组人源化NCG小鼠中，检测外周血CD20+B细胞(左)和CD3+T细胞(右)数量。
为了进一步研究Pin-CD20 eNK细胞在B-淋巴瘤模型中的特异性，Coënon等人接下来设计了一个体内细胞毒性实验，使用两种具有不同表型的细胞系：高表达CD20的Raji细胞和CD20阴性的Nalm6细胞，将eNK和Pin-CD20 eNK细胞与这两种细胞系腹腔共注射。
结果显示，eNK细胞无差别地杀死两种细胞系，而Pin-CD20 eNK细胞选择性地针对并摧毁了CD20阳性的Raji细胞(图4C)。这些数据表明，在体内，Pin-CD20 eNK细胞相对于eNK细胞更优先地靶向表达CD20的细胞。
图4C， 将eNK或Pin-CD20 eNK与 Raji和 Nalm6细胞共腹腔注射于NSG小鼠。4小时后收获细胞，流式细胞术检测靶细胞数。Pin-CD20 eNK选择性地杀死CD20阳性的Raji细胞。
最后，Coënon等人在一个异种移植B-淋巴瘤模型中比较了eNK和Pin-CD20 eNK细胞的抗肿瘤功效。结果发现，eNK和Pin-CD20 eNK细胞都在肺部成功清除了Raji细胞，只有Pin-CD20 eNK细胞完全消除了骨髓中的肿瘤细胞。
这些结果表明，Pin-CD20 eNK细胞在体内对表达同源抗原的靶细胞具有高度选择性，并且能够产生强大的抗肿瘤活性。
Pin-mAbs增强eNK细胞针对原代B-淋巴瘤患者细胞的毒性
研究人员制备了一种抗CD19的Pin-mAb(Pin-CD19)，并用Pin-CD19 eNK细胞以及Pin-CD20 eNK细胞处理了来自不同类型的B-淋巴瘤患者的原代肿瘤细胞。结果显示，与未武装的eNK细胞相比，Pin-CD20 eNK细胞对所有淋巴瘤亚型的细胞毒性都有所增强，而Pin-CD19 eNK细胞能有效清除大部分原代肿瘤细胞，除了滤泡性淋巴瘤(FL)样本(图5A)。
图5A，Pin-CD20 eNK和Pin-CD19 eNK能有效杀伤B淋巴瘤细胞。
值得注意的是，在套细胞淋巴瘤(MCL)和弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者样本中，Pin-CD19 eNK细胞的细胞毒性显著强于Pin-CD20 eNK细胞，这表明在某些淋巴瘤亚型中，CD19可能是更合适的治疗目标。
此外，研究人员还观察到靶细胞上的抗原密度与Pin-mAbs eNK的活性不相关，但未能解释为何Pin-CD19 eNK细胞对FL样本的效率较低。这些结果提示，在肿瘤靶蛋白表达异质性的背景下，对抗多个目标武装的eNK细胞可能更为有益。
双重武装eNK细胞增加了Pin平台的潜力
通过同时用两种针对不同抗原的Pin-mAbs(即Pin-CD20和Pin-CD19)武装eNK细胞，研究人员成功创建了双重武装的eNK细胞。
如同单一武装的细胞一样，在武装后72小时，大约50%的eNK细胞仍然保持着双重武装,表明双重武装并不影响整体的结合效率。
功能测试表明，双重武装的eNK细胞在原发淋巴瘤患者的样本中表现出了与单一武装的eNK细胞相似的效力，这意味着双重武装并没有降低它们识别靶细胞的能力(图6D)。
图6D，淋巴瘤患者细胞与eNK或Pin-CD20和/或Pin-CD19 eNK共培养16小时。流式细胞术检测肿瘤细胞死亡情况。
然而，在所有样本都表达两种抗原的情况下，双重武装并未提高Pin-ADCC效率。研究者假设在异质性细胞群体中，其中细胞只表达一种抗原或两种抗原都表达，双重武装的eNK细胞可能会更加有效。
为了验证这一假设，研究人员选择了既表达CD20和CD19(Daudi细胞)，以及不表达CD20但表达CD19(Nalm6细胞)的细胞系进行实验。通过实验证明，双重武装的eNK细胞确实能够杀死两种靶细胞，而单一武装的eNK细胞则无法针对那些缺失一个抗原的靶细胞。因此，双重武装的eNK细胞尤其适用于治疗表现出显著表型异质性的肿瘤。
结论
在这项研究中，Coënon等人展示了新型抗肿瘤细胞疗法产品Pin-mAb eNK的临床前开发过程，该产品利用NK细胞强大的ADCC能力杀死B-淋巴瘤细胞，通过将效应细胞与mAbs的具体靶向相结合。他们报道了多种Pin-mAbs在体内外都能有效地诱导Pin-ADCC，提供了优于未武装eNK细胞的效果。
除了这里描述的mAbs之外，Pin技术还可以将eNK细胞与几乎任何针对相关肿瘤靶标的mAb结合起来。Pin技术也可以应用于其他表达或经过改造表达CD16a的效应细胞。最后，可以设计出一系列携带Pin突变的Fc构建体。这些构建体可以包括识别靶细胞受体的蛋白质或肽。
这种新型抗肿瘤细胞疗法的优势在于其简单性，具有易于操作的特点，可以用于生成广泛的临床相关mAbs武装的NK细胞。然而，局限性包括其依赖于表达FcγR的细胞以及细胞和mAb在与靶细胞接触后的相对短暂的寿命，这意味着需要在患者中重复给药。总的来说，Pin平台具有开发有效抗肿瘤细胞疗法产品的巨大潜力。
参考文献：
Coënon, Loïs et al. “Generation of non-genetically modified, CAR-like, NK cells.” Journal for immunotherapy of cancer vol. 12,7 e009070. 18 Jul. 2024, doi:10.1136/jitc-2024-009070
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