单细胞CAR-T图谱揭示8年白血病持续缓解患者中的2型免疫反应抗肿瘤功能

撰文：单旅 | 编辑：戴戴

2024年9月，来自耶鲁大学生物医学工程系的樊荣教授课题组联合Carl H. June、Stephan A. Grupp、J. Joseph Melenhorst和唐力团队在《Nature》上发表了题为“Single-cell CAR T atlas reveals type 2 function in 8-year leukaemia remission”的研究，发现2型免疫在维持经CAR-T治疗的B-ALL患者超8年无癌临床反应中发挥关键作用。“细胞知聊”本期为您带来相关内容介绍。

为研究超长时间CAR T细胞持久性的分子决定因素，作者分析了82名复发或难治性急性淋巴细胞白血病（ALL）儿童患者的预输注CD19靶向CAR T细胞（CTL019）产品，同时也分析了来自6名健康供体的CAR T细胞。82名患者中，6名未表现出任何客观治疗反应，被定义为无反应者（NR）。24名患者在中位时间9.2个月时复发，伴随CD19+白血病细胞（CD19+复发，RL+）；另有27名患者在中位时间8.9个月时复发，丧失了CD19表达（CD19-复发，RL−）。其余25名患者在最后一次随访时仍处于持续的无复发缓解状态，被定义为完全缓解者（CR）。

▲图1-1:  来自82例患者和6例健康供体的695,819个CAR-T细胞的单细胞图谱

首先，作者从总计1,029,340个预输注的CAR T细胞中获取了单细胞转录组和表面蛋白表位测序数据，通过无监督聚类和UMAP可视化整合数据集，识别出了17个亚群（图1b），并展现了不同抗体衍生标签的表达模式，包括T细胞亚型标记物CD4和CD8、活化T细胞标记物CD69和初始T细胞标记物CD62L。

▲图1-2: 来自82例患者和6例健康供体的695,819个CAR-T细胞的单细胞图谱

▲图2-1: CAR T产品2型功能升高与8年超长缓解相关

对APC激活的CD4+和CD8+ CAR+细胞进行流式细胞术分析证实，BCA-L组中表达IL-3、IL-4、IL-5、IL-13和IL-31的细胞比例显著增加，其显著性水平明显高于持续性较差的BCA1和BCA2组（图2e）。BCA-L和BCA-O组患者中分泌2型细胞因子IL-4、IL-5、IL-9、IL-13和IL-21的CAR T细胞指数显著更高（图2f），而IL-10单独的分泌水平未显示出明显差异。

▲图2-2:CAR T产品2型功能升高与8年超长缓解相关

▲图2-3: CAR T产品2型功能升高与8年超长缓解相关

接下来，作者进行了差异化基序分析，以识别开放染色质区域内的潜在转录因子结合位点（图2i）。在BCA-L CAR T细胞中观察到的显著增强的基序结合活性中，GATA3作为主要的差异富集位点，同时还有其他几个GATA家族成员。TBX21在所有患者中表现出一致的水平，而GATA3在来自BCA-L组的三名患者的单细胞中显示出显著富集的活性（图2i）。值得注意的是，在这一分析中，STAT6并未作为差异性基序出现。相反，属于IRF家族的转录介质在BCA-L CAR T细胞中显著减少，其中IRF4积极参与促进T细胞耗竭和介导细胞代谢受损。

作者使用GATA3、STAT1和TBX21的位置信息追踪其结合动态，揭示出BCA-L组中GATA3的可及性显著增加（图2j）。为了评估STAT6和GATA3在协调2型功能中的相对重要性，作者使用STAT6或GATA3敲低的CAR T细胞进行了体外重复刺激实验（图2k）。尽管这两种敲低均显著削弱了肿瘤杀伤效能，但GATA3敲低在实验结束时显示出更为显著的CAR T细胞数量下降，提示其在维持长期持久CAR T细胞中功能性2型免疫的中心作用。综上所述，这些数据表明，在BCA-L和BCA-O组患者中观察到的延长治疗效力与GATA3上调调控的增强2型功能相关。

▲图2-4: CAR T产品2型功能升高与8年超长缓解相关

为了研究2型功能如何调节CAR T细胞以维持其持久性，作者基于scRNA-seq数据集中的配体-受体（L-R）对表达模式，考察了细胞间相互作用。在来源第7簇的2型细胞的L-R通信通路网络中，最突出的相互作用汇聚于第2簇细胞，占总体的13.9%。与2型细胞因子相关的信号主要由Il2RG、CD53和CSF2RB等受体基因接收，这些基因普遍参与T细胞的生存、增殖及下游免疫功能（图3a），这提示了2型CAR T细胞对整个细胞群体的潜在调节作用。此外，靶向第2簇细胞的L-R相互作用主要涉及2型细胞因子，第2簇中接受2型配体的受体（如Il2RG、CD53、CSF2RB、Il4R和Il3RA）表现出最高的表达水平（图3c）。

差异表达基因（DEGs）分析发现，第2簇细胞中细胞毒性效应基因GNLY和GZMA的表达显著增加（图3d），伴随着细胞毒性评分的集中分布，表明其具有高度的细胞毒性表型。此外，T细胞凋亡基因Il32和参与T细胞耗竭途径的基因CALM1的表达也显著上调。相反，细胞因子产生能力大幅下降，表现为IFNG、CSF2、Il2、Il3、Il5、Il13、XCL1/2和CCL3/4的显著下调。GO分析显示，T细胞激活和功能所必需的重要通路显著抑制（图3e）。与此同时，凋亡信号、MYC介导的凋亡、T细胞耗竭信号通路及钙诱导的T淋巴细胞凋亡同时被激活，表明这些细胞由于细胞毒性的过度产生而可能呈现终末效应器特征。

 ▲图3-1: 2型CAR T细胞调节功能失调的亚群

  ▲图3-2: 2型CAR T细胞调节功能失调的亚群

为研究患者在CAR T细胞输注后的反应，作者对来自发现队列的33名患者（包括4名BCA-L组患者）和验证队列的8名患者（包括3名BCA-O组患者）进行了全面的蛋白质组学分析，以测量治疗后血清蛋白水平（图4a）。在两个队列中，长期BCA-L和BCA-O患者的2型细胞因子水平显著升高，尤其是IL-13（图4b）。相比之下，长期反应者和其他患者之间的1型细胞因子及选定趋化因子的水平未见显著变化。

在对多个时间点的统计分析中，BCA-L组患者在基线测量（CTL019输注前0到2天）时显示出显著更高的2型细胞因子水平（图4c）。这一现象营造了一个富含2型细胞因子的环境，促进了细胞动力学的变化，从而导致BCA-L细胞的平衡反应。在输注的初始阶段（第1-5天），由于循环CTL019细胞的瞬时减少，导致其在外周血、骨髓和其他组织中的分散，因此未观察到显著差异。随着输注后的快速扩增期（第6-8天）一直持续到2个月后，BCA-L组患者的循环2型细胞因子水平持续显著升高（图4c）。

 ▲图4: 长期反应者在治疗后血清中表现出较高的2型细胞因子水平

接下来作者研究了增强2型功能是否可以提升2型低表达CAR T样本（ND585）的表现，采用了两种策略：(1)在输注前用2型细胞因子对CAR T产品进行预激活；(2)在制造过程中引入2型细胞因子，从采集的T细胞开始（图6a）。在新制造的ND585 T细胞中评估了两种不同的IL-4剂量，即10 ng/ml或50 ng/ml，分别生成增强的2型CAR T细胞，称为ET2-L CAR T细胞或ET2-H CAR T细胞。

所有新生成的CAR T细胞被输注到携带Nalm6细胞的NSG小鼠中，并将它们的疗效与来自相同供体制造的原始2型低表达CAR T细胞进行了比较。尽管所有治疗组在1周内成功清除了肿瘤，只有经过预激活的CAR T细胞和ET2-L/H CAR T细胞显示出完全清除肿瘤细胞再挑战的能力（图6b），突显了通过增强2型功能性提高CAR T细胞治疗的潜力。在CAR T细胞输注后的各个时间点进行的流式细胞术分析显示，新产品在外周血中CAR+细胞显著扩增（图6c），同时在第8天峰值时，抑制性标记物的表达显著降低，IFNγ的产生增加。这与它们显著延长生存期的优越能力相一致（图6d）。

 ▲图6: 2型免疫低的CAR T细胞通过增强2型功能表现得到提升

作者以接受CD19 CAR-T治疗的儿童B-ALL患者为研究对象，通过单细胞多组学测序技术，揭示了2型免疫在CAR-T治疗后的功能特性及其与长期无癌生存的关联。研究发现，维持超8年临床缓解的患者2型 CAR-T细胞的比例显著高于其他患者。这一发现颠覆了传统观点，表明2型免疫在特定情况下，尤其在血液肿瘤中，对CAR-T疗法的持久性至关重要。这一发现揭示了2型免疫反应在肿瘤免疫中的未知功能，挑战了传统免疫学关于2型免疫应答在肿瘤免疫中负面作用的认知，提供了对持久的CAR-T治疗反应的介质的新见解，并提出了通过增强CAR-T细胞的2型功能来维持长期缓解的潜在治疗策略。

版权说明：

本文由“细胞知聊”团队编译，仅作信息交流之目的，旨在传递细胞治疗领域讯息和前沿进展。文章内容仅代表作者个人观点，不构成任何价值判断、投资或医疗指导建议，如有需求请咨询专业人士或前往正规医院就诊。

欢迎个人分享转发至朋友圈。媒体或机构转载请在“细胞知聊”微信公众号留言或私信公众号名称，审核通过后开通白名单获取转载授权，转载请标识来源。