双靶点CD19-22 CAR-T细胞联合IL-15用药治疗B-ALL

首先，研究团队考虑设计一个能够同时靶向CD19和CD22的CAR结构，以消除靶向抗原丢失的影响。科研人员设计了scFv串联以及替代序列形成环状结构开发双表位CAR，其具体构造如图一所示。通过检测表面CD22和CD19的表达水平、IL-2的分泌表达以及对CD22+CD19+ Nalm 6体内杀伤效果对比，显示串联(Tandem)CAR整体效果弱于环状(Loop)CAR。其中效果最好的LoopCAR 6对于CD19- Nalm6/CD22- Nalm6的体内杀伤，效果远远优于其他结构。

研究团队针对LoopCAR 6即CD19-22 CAR-T细胞开展了I期临床实验，并在2021年8月在《Nature Medicine》上汇报了结果。在该研究中提供的临床数据表明，CD19-22 CAR T细胞在B-ALL中均具有临床活性，88%达到MRD-CR，在LBCL中ORR为62%。毒性较低：分别有5%和11%出现≥3级CRS或神经毒性。与具有相同scFV的单特异性CAR相比，CD19-22 CAR显示出TNF-α和IL-2分泌减少。在该试验中10名患者出现复发，中位无进展生存期(PFS)为5.8个月。10名患者中有5名在复发时保留了CD19和CD22表达，这表明除抗原丢失之外的其他机制可能是导致疾病进展的原因。因此，需要同时通过其他手段改善CAR19-22的抗肿瘤反应可能会促进持久缓解。

图二：CD19-22 CAR-T细胞I期临床实验结果。（A）21名淋巴瘤患者注射CD19-22 CAR-T细胞后的持续时间和持续反应示意图。（B）17名B-ALL患者注射CD19-22 CAR-T细胞后的持续时间和持续反应示意图。（C）在B-ALL患者治疗前和进展后通过常规流式细胞术评估CD19和CD22，结果显示CD19丢失而CD22保留.（D）CD19-22 CAR T治疗后进展时的CD19和CD22抗原密度（n=11名患者），患者S24以绿色突出显示。6名患者的CD19分子数小于1,150/细胞，CD22中位数约为6,000/细胞。虚线表示截止值为3,000/细胞CD19分子。（E）ICS刺激CD19-22(n= 11)与单特异性CD22 (n= 5) CAR产品对抗CD22高表达的细胞系，结果显示通过单特异性CAR22可增加IL-2和TNF-α的细胞因子分泌。

在针对B细胞恶性肿瘤的CD19 CAR T细胞1/2期临床试验(#NCT01865617)中，CAR T细胞输注后血清白细胞介素15(IL-15)浓度低与CAR T细胞动力学较差有关。IL-15支持T细胞增殖和存活，因此，补充IL-15可能会增强CAR T细胞疗法。然而，由于天然IL-15的药代动力学(PK)和毒性较差，其临床应用具有挑战性。

NKTR-255是一种聚合物结合的IL-15，附着于聚乙二醇（PEG）部分，可与整个IL-15受体复合物 (IL-15Rα/IL-2Rβγ)结合并表现出清除率的降低，从而提供持续的药效学(PD)反应。研究团队利用NKTR-255治疗非人类灵长类动物的PK和免疫细胞PD，发现NKTR-255增强了T细胞和自然杀伤细胞的体内增殖。在体外，NKTR-255诱导剂量依赖性人CD19 CAR T细胞增殖和积累，尤其是在靶细胞丰度较低的情况下。在患有淋巴瘤的免疫缺陷小鼠中进行的体内研究表明，与仅接受CAR T细胞治疗的小鼠相比，接受CAR T细胞和NKTR-255治疗的小鼠血液和骨髓中的CAR T细胞计数明显较高，并且在肿瘤清除后仍保持较高水平，并且没有持续增殖或持续激活/耗竭的证据（通过Ki-67和抑制性受体共表达评估）。

图三：NKTR-255促进CAR-T细胞增殖以及增效体内抗肿瘤活性。（A）NKTR-255随着浓度的升高能线性增加CD4+和CD8+CAR-T细胞的增殖（B）在不同效靶比的条件下，高浓度的NKTR-255能有效刺激CD8+CAR-T细胞的分裂增殖。（C）NKTR-255 以剂量依赖性方式增强人类 CD19 CAR T 细胞在体内的抗肿瘤功效。（D）NKTR-255增加人类CAR T细胞在患有淋巴瘤的小鼠骨髓中的积累和存活率。

基于上述以往的研究以及临床结果，研究团队开展了CD19-22 CAR-T细胞联合多次NKTR-255给药治疗成人的复发/难治性B-ALL的I期临床实验。

总共有11个病人纳入临床试验，并且所有的CD19-22 CAR-T细胞都制备成功并注入病人体内。但是有2例病人在14天时分别有3级感染和3级免疫效应细胞相关噬血细胞性淋巴组织细胞增生症样综合征（IEC-HS），因此不合适注射NKTR-255。接受CD19-22 CAR-T联合NKTR-255治疗的9例病人大部分都为费城染色体(Ph)阴性（89%），并且前期接受多线治疗。8例病人具有较低的肿瘤负担，1例病人由于存在巨大的髓外疾病导致肿瘤负担高。以前期接受CAR19-22的8例病人作为对照组。

8例患者（89%）达到CR的水平，所有患者均未检测到MRD。两名患者在CR时接受了异基因HCT。三名患者(33%)复发（一名患者CD19丢失），均发生在CAR19-22治疗后六个月内。对于接受NKTR-255治疗的患者，12个月PFS为67%，经过14.4个月的随访，中位PFS尚未达到。

所有患者在输注CAR19-22和NKTR-255后的一个月内，在血液中均可以检测到CAR+T细胞。NKTR-255输注后D14，CAR19-22 qPCR检测数值的变化不大，但在D15天时，我们观察到CD4+和CD8+ CAR19-22细胞的下降。同时，研究团队在NKTR-255后D14相同时间点评估了总淋巴细胞动力学。在D15，与输注前D14相比，NKTR-255治疗患者的绝对淋巴细胞计数(ALC)显着下降，D28时淋巴细胞与D15相比显著反弹，但是这些反弹的淋巴细胞大部分并不表达CAR。在对照组和NKTR-255治疗组患者中，CAR19-22在外周血中一直可检测到相似水平的表达，直至第180天。

鉴于IL15在淋巴细胞运输中的作用、血液中CXCL9和CXCL10的增加以及ALC和CD8+ CAR19-22 的减少，作者假设NKTR-255可能正在驱动淋巴细胞进入组织。因此，研究团队对NKTR-255队列中确诊为CNS疾病的两名患者的血液和CSF中的CAR水平进行了分析。在NKTR-255给药后，两名患者的血液中的ALC和CD8+ CAR均减少，但两名患者的CSF中CAR+细胞均增加了10倍，其中患者1的增加发生在D17，而患者2的增加发生在D20，均提示向CNS的运输。但是经检测并未驱动向骨髓运输。而对照组中有CSF样本的三名患者并未发现CSF中CAR+T的增加。

图四：CD19-22 CAR-T联合NKTR-255临床结果（A）接受联合治疗患者具体情况泳图。（B）CAR19-22 输注后第一个月内的IL15。图中显示的是对照组(橙色)和NKTR-255组(青色)患者的IL15 MFI的中位数和四分位距。（C）D14 NKTR-255输注前和输注后及D15细胞因子的分泌情况。（D）CAR19-22扩增和持久性。图中显示的是CAR输注后第一个月外周血中的CAR19-22水平（中位数和四分位距）。

研究团队创新性地将重组细胞因子产品与CAR-T细胞疗法相结合，并证明这种方法既可行又安全。所有患者均成功制造和输注了CAR19-22，88%的患者至少接受了NKTR-255输注。接受NKTR-255治疗的患者最常见的不良反应是发烧、发冷和骨髓抑制，这些不良反应可通过支持治疗控制，并且与单独使用CAR19-22后出现的毒性相当。我们在任何测试的NKTR-255剂量下均未观察到DLT；然而，我们确实注意到在最高剂量6.0 mcg/kg时更明显的血细胞减少症。

单独给予CAR19-22的MRD阴性反应与联合给药相当，达到88%，但58%的患者在CAR输注后6个月内复发。然而，中位随访时间为14.4个月，接受联合治疗的患者中只有三名(33%)复发，这可能表明NKTR-255的给药有助于预防早期疾病复发。NKTR-255的一个重要功能可能是促进淋巴细胞向肿瘤组织的运输。NKTR-255给药后，我们观察到通常由活化T细胞分泌的细胞因子（包括CXCL9和CXCL10）急剧增加，这些细胞因子促进淋巴细胞迁移到组织中，并在组织中对肿瘤细胞产生作用。

总之，该研究团队创新性的使用新型CD19-22 CAR-T细胞产品后再输注聚乙二醇化IL15受体激动剂，在临床测试中显示出很好的安全性及有效性。并在患者体内观察到NKTR-255可能会改善淋巴细胞向组织的运输，并激活CAR和非CAR介导的抗肿瘤免疫。

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