撰文：阿嫣 | 编辑：珊珊
CAR T 细胞疗法在血液癌症中显示出显著的疗效，但对实体瘤的效果甚微。其中一个原因是，相比靶向实体瘤抗原的CAR-T细胞，靶向CD19的CAR-T细胞具有更强的扩增能力。
有研究发现，通过将CAR-T细胞与非转导的T细胞混合并在体外扩增后再施用，可以促进两类T细胞群体的增殖。于是有学者认为，凭着这一特性，CAR-T细胞疗法有望能像在血液癌症中一样，改变晚期结直肠癌和其他实体瘤的治疗格局。
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结直肠癌(CRC)是全球癌症死亡的第二大原因，大约一半的患者最终发展为晚期、无法治愈的CRC。近几十年来针对结直肠癌开发的有效治疗方法很少，因此医学研究人员将治愈的希望寄托在CAR-T细胞疗法上。
研究发现，CD19 CART促进了共注射的靶向实体瘤抗原(如鸟苷酸环化酶C [GCC])的CAR-T细胞的增殖，鸟苷酸环化酶C(GCC)在70%~80%的结直肠癌转移灶中表达。
鸟苷酸环化酶C(GCC)在正常组织中的表达仅限于肠上皮细胞的顶端(apical surfaces)，这些细胞面向肠道内部的空间。由于紧密连接的存在，GCC被隔离在肠道内部，不能直接与全身循环中的物质接触。因此，T细胞无法接触到它。
这一特性意味着GCC在正常情况下不会引发免疫系统的过度反应，因为T细胞无法轻易接触到它。这也解释了为什么GCC可以作为一个相对安全的靶点用于CAR-T细胞疗法，因为它在正常组织中的表达是受到严格限制的，降低了对正常组织的潜在伤害。
与此同时，转导编码干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-6和IL-12的基因可增强CD19 CART细胞的增殖、迁移以及向恶性肿瘤的浸润。于是，科研人员开发了耦合CAR(CoupledCAR)平台，由靶向特定实体瘤抗原的CAR T细胞(例如针对鸟苷酸环化酶C(GCC)的GCC CAR T细胞)，以及三个含有上述armor的CD19 CAR T细胞亚群(每个亚群被设计为在单一产品中表达IFN-γ、IL-6或IL-12)组成。
吉林大学第一医院肿瘤中心的陈耐飞等学者报告了使用这种方法构建的临床候选药物 GCC19 CART在转移性结直肠癌(mCRC)患者中的安全性和初步抗癌活性。研究结果于2024年9月发表在《Jama Oncology》期刊上，题目为“Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting CD19 and GCC in Metastatic Colorectal Cancer-A Nonrandomized Clinical Trial”。
该研究结果表明，GCC19CART在经过大量前期治疗的转移性结直肠癌患者中是安全且可耐受的。该研究是第一个在mCRC患者中进行的CAR_T I期临床试验，展示了在实体瘤治疗中的潜力。尽管如此，还需要进一步的研究来验证其长期疗效和安全性。接下来，“细胞知聊”为您带来具体内容介绍。
一、研究设计和治疗
2020年12月至2021年9月期间，共有25名患者接受了筛选，其中15名转移性结直肠癌(mCRC)患者接受了GCC19CART治疗，另有10名患者不符合入选条件。入选患者的中位年龄为44岁。14名患者在接受多种先前的标准治疗时出现程序性细胞死亡(中位数，3线治疗)，而1名对初始治疗不耐受的患者仅接受了第一线治疗。
在输注GCC19 CART细胞(1×10^6 或 2×10^6 细胞/kg)前3天，单次给予氟达拉滨30 mg/m^2 和环磷酰胺300 mg/m^2 进行淋巴细胞耗竭。
图 1. 从筛选到长期随访的试验进展。
二、研究结果
1、安全性和毒性
15名患者中有14名(93%)经历了至少一次3级或以上的不良事件(AE)。14名参与者(93%)出现了细胞因子释放综合征(CRS)的症状，其中13名(87%)和1名(8%)分别经历了1级和2级的CRS。CRS的中位发作时间是在输注后的第4天，中位持续时间为4天。
表.15例GCC19 CART治疗后不良事件分析
12名患者(80%)接受了托珠单抗治疗，以应对细胞因子释放综合征，而5名(33%)和3名(20%)患者分别接受了糖皮质激素和/或达沙替尼治疗。1名患者经历了4级的神经毒性反应，但在30天内通过大剂量的糖皮质激素治疗后，情况得到缓解。
14名患者(93%)出现了腹泻，其中6名经历了1到2级事件，8名经历了3级事件。腹泻的中位发作时间是第9天(范围5-14天)，3级或以上腹泻的中位持续时间为5天(范围1-13天)。3级腹泻通过糖皮质激素、达沙替尼和/或英夫利昔单抗以及其他常规的止泻药和支持性护理药物进行治疗。其中，6名患者接受了糖皮质激素治疗(1-2 mg/kg 甲泼尼龙或5-10mg地塞米松)。3名患者接受了达沙替尼治疗，而11名患者接受了英夫利昔单抗治疗。尽管腹泻偶尔复发，但所有患者的腹泻都得到完全缓解。
所有患者都经历了短暂且可逆的血液学方面的不良事件(Adverse Events)，主要是1到2级。这些血液学不良事件通常在2到3天内自行缓解。淋巴细胞减少可能归因于治疗效果，在 3 个月内得到缓解。没有出现与研究相关的死亡病例。
2、无进展生存期
接受较高剂量治疗的患者的中位无进展生存期为6个月，显著高于接受较低剂量治疗的患者(1.9个月)。
图 2. 15例接受GCC19 CAR T治疗转移性结直肠癌患者的无进展生存期(PFS)
3、总生存期
截至数据截止日期，中位总生存期为22.8个月，中位随访时间为22.8个月。
图 3. 15例接受GCC19 CAR T治疗转移性结直肠癌患者的总生存期
4、缓解情况
在15名患者中，6名(40%)经历了部分缓解(PR)，包括3例未确认的部分缓解。缓解的中位持续时间为5.1个月。另外5名患者的最佳反应为病情稳定(SD)，总体临床获益率为73%。
15名患者中1名患者获得完全代谢缓解，10名患者获得部分代谢缓解(包括剂量1水平的5名患者(63%)和剂量2水平的6名患者(86%))。
5、CAR-T细胞在体内的扩增
使用定量PCR(qPCR)最早在输注后2天检测到CAR载体拷贝，GCC CAR-T载体拷贝数达峰在中位时间10天(范围7至12天)，峰值在10,000-100,000 copies/ug gDNA之间。
通过流式细胞术检测到所有患者中都有GCC CART细胞，GCC CART细胞的中位峰值扩增发生在10天左右(范围8至11天)。
无论是通过拷贝数还是细胞数评估，GCC19 CART在较高剂量组患者的扩增和持久性都优于较低剂量组。
图4.在GCC19CART治疗后通过定量聚合酶链反应(qPCR)检测外周血样本中CAR载体拷贝数的测量结果。
所有患者中循环细胞因子显著增加，表明存在免疫激活。IL-6、INF-γ和颗粒酶B水平在输注后立即增加，并在大约1周后达到峰值。随后在2到3周后观察到第二个峰值。在两个剂量水平下，这些细胞因子水平在GCC19CART治疗后直到大约第30天之前波动不定。
图5.对IL-6、INF-γ和颗粒酶B等细胞因子进行连续测量的结果。
6、转导的T细胞表达不同载体的情况
研究人员使用qPCR监测四种载体在外周血中的拷贝数，以考察CAR阳性细胞的频率与这些载体拷贝数之间的关系。
图6.通过定量聚合酶链反应(qPCR)检测在外周血样本中表达不同转基因的转导T细胞中的CAR拷贝数(部分)。
通过整合流式细胞术获得的CAR阳性细胞频率数据和qPCR获得的拷贝数数据，揭示CAR-T细胞在外周血中的动态变化。结果表明CAR阳性细胞的频率与其相应的拷贝数相关。这些分析有助于理解CAR-T细胞在治疗过程中的扩增和持久性，以及免疫反应的相关性。
图7.通过流式细胞术和qPCR检测的每位研究患者的GCC CAR-T细胞数量(部分)。
7、探索性分析(Exploratory studies of paired biopsy )
对1名患者的治疗前和治疗后活检样本进行了单细胞RNA测序，以了解CAR-T细胞在肿瘤微环境中的性质。
使用单细胞RNA测序和无监督分析，在患者在接受CAR-T细胞治疗前后的活检样本中鉴定了19个不同的细胞簇。每个细胞簇通过经典标记物进行注释，包括T细胞(CD3D、CD3G)、巨噬细胞(C1QA)、树突状细胞(DCs)(CD1C)、自然杀伤细胞(NK细胞)(KLRF1、KLRD1)、中性粒细胞(CD16B)、B细胞(CD19、CD79A)、成纤维细胞(DCN、COL6A1、MMP2)和癌细胞(KRT8、KRT18、KRT19、EPCAM)。
通过基因集富集分析(GSEA)在实体瘤中的巨噬细胞群体中评估已知途径的表达，结果显示与抗原处理和呈递、细胞黏附以及自然杀伤(NK)细胞介导的细胞毒性相关的途径有强烈的富集。
图8.在输注前后肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)中上调基因(顶部)和下调基因(底部)的基因集富集分析(GSEA)(P<0.05)
在治疗前后取样的癌组织中检测到正常T细胞差异表达的基因。治疗后观察到代表细胞周期和细胞毒性相关特征基因的mRNA水平增加，而在治疗前，衰竭和记忆相关基因优先在正常T细胞中表达，这表明非CAR-T细胞在接受GCC19CART治疗后被激活。
图9.在输注前后非CAR-T细胞(NTs)中上调基因(顶部)和下调基因(底部)的倍数变化(P<0.05)
在治疗后取样的肿瘤中的NK细胞中，观察到代表JAK-STAT、细胞黏附和细胞毒性相关基因表达的mRNA水平，而在治疗前，TGFβ基因优先在NK细胞中表达，这表明癌组织中的NK细胞也被GCC19CART激活。这些结果表明，在注入GCC19CART后，NK细胞被激活。
图10.在输注前后自然杀伤细胞(NK细胞)中上调基因(顶部)和下调基因(底部)的倍数变化(P<0.05
这些结果表明，GCC19CART治疗不仅激活了CAR-T细胞，还激活了其他免疫细胞(如T细胞和NK细胞)，从而增强了整体的抗肿瘤免疫反应。
三、讨论
与血液恶性肿瘤不同，靶向GCC的CAR-T细胞可能会通过与肠道腔内的GCC结合而导致自限性腹泻。在该试验中，通过支持性护理措施以及英夫利昔单抗、达沙替尼和糖皮质激素可以有效应对腹泻。
尽管GCC19 CART产品中工程化了编码IFN-γ、IL-6和IL-12的基因，但并未观察到严重的CRS表现。GCC19CART的临床活性归因于CoupledCAR平台，该平台使用CD19 CAR-T细胞来扩增靶向CRC的GCCCAR T细胞。
GCC19 CART的疗效表明，其在未经大量前期治疗的个体中可能具有潜在效果，或者可以作为高风险复发患者的巩固 / 辅助治疗。同时，在有限的病例中，临床数据显示GCC19CART在伴有肝转移的晚期CRC患者中有明确疗效。
尽管没有观察到完全缓解，但该试验可能被视为未来CRC和其他实体瘤研究的基础，特别是在较早阶段的疾病中。CoupledCAR的这种机制方法或能扩展到其他CARs和过继性细胞免疫疗法，有望为更广泛的实体瘤治疗开辟新的途径。
四、结论
这项临床试验表明，GCC19CART在经过大量前期治疗的复发或难治性转移性结直肠癌(CRC)患者中具有良好的安全性及其显著的临床客观缓解率。
参考文献：
Chen, Naifei et al. “Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting CD19 and GCC in Metastatic Colorectal Cancer: A Nonrandomized Clinical Trial.” JAMA oncology, e243891. 19 Sep. 2024, doi:10.1001/jamaoncol.2024.3891
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