撰文：Rainbow | 编辑：珊珊
背景
CBFA2T3-GLIS2(C/G)融合是非唐氏综合征急性巨核母细胞白血病(AMKL)隐性易位的产物，主要见于婴儿和幼儿，其预后较差。
往期推送：
《中国研发人员尝试过表达C-JUN的CAR-T细胞治疗AML：临床前及I期临床结果》
2022年11月，来自美国西雅图福瑞德·哈金森癌症研究中心的Soheil Meshinchi 团队在《The Journal of Clinical Investigation》上发表了题为“CBFA2T3-GLIS2 model of pediatric acute megakaryoblastic leukemia identifies FOLR1 as a CAR T cell target”的研究。
研究人员开发了一种白血病模型，证明了C/G致癌融合蛋白的表达促进了内皮细胞共培养系统中，人脐带血造血干细胞和祖细胞(CB HSPCs)的转化，该系统重现了C/G急性髓系白血病(AML)的转录组、形态和免疫表型，并在异种移植模型中诱导了高度侵袭性白血病。此外，研究人员开发了靶向叶酸受体α (FOLR1)的CAR-T细胞，并在体外和异种移植模型中证明了它们对C/G AML的临床前疗效。“细胞知聊”本期将为您带来相关内容介绍。
结果
C/G的表达可转化人CB HSPCs并诱发白血病。
科研人员通过慢病毒转导的方式制备了表达C/G 融合蛋白的人CB HSPCs(C/G-CB)，并移植到 NSG-SGM3 小鼠体内(图1A)。移植60天后，相比于对照组，所有注射C/G-CB的小鼠(4/4)均发生了白血病而死亡(图1B)。流式细胞术分析骨髓C/G-CB异种移植细胞表型具有RAM免疫表型(CD56hi, CD45dim和CD38dim/-)，与C/G患者源性白血病细胞和先前在C/G型AML婴儿中报道的细胞表型一致(图1C，D)。
图1(A-E) C/G-CB细胞诱导白血病，再现原发疾病。
为了评估C/G是否增强了白血病起始细胞(LICs)的自我更新能力，研究人员通过C/G- CB细胞的连续移植实验发现第二代和第三代移植物均能导致小鼠产生AML，且中位生存期分别为69天和72天(图1F)。此外，在初次和连续移植C/G- CB细胞中发现了巨核细胞异常表型(CD41-CD42 +)，而在原发性C/G细胞PDX模型中也检测到这种异常的巨核细胞亚群(图1I)。总之，研究人员在异种移植模型中证明了，C/G的表达诱导了类似于人C/G AMKL的形态和免疫表型的CB HSPCs的转化。
图1(F,I) C/G-CB细胞诱导白血病，再现原发疾病。
内皮细胞(ECs)共培养系统会促进C/G-CB细胞的长期自我更新和白血病转化
研究人员又设计了一个长期培养系统，使用E4 ECs来支持转导的CB干细胞的生长和转化，以模拟和监测白血病发生过程中的变化。与促髓系细胞生成条件(MC)相比，EC共培养的C/G-CB细胞增殖更快，寿命更长(图2A,B),且直接接触EC更利于C/G-CB细胞的增殖(图2C)。除此之外，与EC共培养后，C/G-CB细胞会产生更多的巨核细胞集落(图2D)。说明了C/G-CB细胞与EC共培养具有长久的自我更新能力。
图2(A-D) ECs增强C/G-CB细胞的增殖并促进白血病进展
为了监测EC长期培养过程中白血病免疫表型的演变，研究人员评估了细胞AMKL标记物和C/G AMKL的RAM免疫表型特征(特点是CD56高表达，CD45和CD38低/阴性表达)。共培养6周后，与EC共培养的 C/G-CB 细胞表型与RAM免疫表型一致，且持续高表达CD56，而与MC共培养的细胞仅存在一小部分RAM表型的细胞(图2F,G)。总之，EC共培养可支持C/G转化的CB HSPCs的发展，随着RAM免疫表型的表达演变为白血病，与原发性C/G AML非常相似。
图2(F,G) ECs增强C/G-CB细胞的增殖并促进白血病进展
恶性转化与治疗靶点FOLR1的上调有关
研究人员通过检测与ECs共培养的C/G- CB细胞和原代C/G AML的转录组，确定了两者之间共同的上调基因。在多个候选膜表达蛋白选定了FOLR1,该蛋白在在C/G- CB细胞和C/G患者中高度表达，但在正常细胞中基本不表达(图3A-E)。15个 C/G阳性样本中，12个样本表达FOLR1(80%)。
图3(A-E) FOLR1治疗靶点的发现
针对C/G AML 靶向FOLR1 CART的开发
随后，科研人员开发了三种结构的CAR-T，包括scFv、IgG4铰链区(分短、中、长三个长度)、CD28跨膜区、41BB共刺激区，其中scFv来源于抗FOLR1 的 farletuzumab抗体(图4A)。杀伤实验结果显示，虽然三种结构针对不同 FOLR1+细胞系的杀伤效果相类似，但从因子分泌水平上来看，明显IgG4中间长度的CAR结构促炎因子分泌水平最高(图4C，D)。因此，在后续实验中均采用此CAR结构进行验证。
图4(A,C,D) FOLR1 CART的构建和功能检测
FOLR1 CAR - T在C/G AML中表现出较好的临床前疗效
研究人员进一步验证了FOLR1 CAR - T的靶向特异性，证明其仅杀伤FOLR1阳性细胞，而对FOLR1阴性细胞无影响(图5A)。
此外，在C/G-CB (EC共培养大于9周)、WSU-AML和Kasumi-1 FOLR1+异种移植物小鼠模型中 ，CAR-T细胞均能特异性清除大部分白血病细胞并延长小鼠的生存期(图5D，E)。
图5(A,D,E) FOLR1 CAR - T细胞对C/G AML细胞的临床前疗效
FOLR1 CAR - T细胞不影响正常造血干细胞的活力、自我更新和多系分化
研究人员发现FOLR1在HSPC各个亚群中基本不表达(图6A,B,C)，且FOLR1 CAR-T细胞对HPSCs也并无溶解作用(图6D)。此外，对HPSCs的自我更新和分化也无影响(图6E)。综上所述，这些结果表明FOLR1 CAR - T细胞可以在不损害正常HSPCs的情况下根除C/G AML细胞，可能是一种很有前途的C/G AML治疗方法。
图6(B-E) 靶向FOLR1的CART细胞有效清除C/G-CB细胞且不影响HPSCs的活力
结论
目前，由于缺乏准确概括人类疾病的相关人类模型系统，阐明疾病机制和开发C/G AML新疗法的进展受到限制。本研究中，作者证明了C/G致癌融合蛋白促进CB HSPCs细胞转化成白血病细胞，与儿童C/G AMKL细胞具有相似的转录组、细胞形态以及免疫表型。且与ECs共培养后会促进白血病的转化并保持自我更新超过90天。作者利用此模型发现了FOLR1治疗靶点，并开发了针对此靶点的CAR-T细胞，有效清除C/G白血病细胞的同时，对HPSCs并无影响，为这种高风险AML亚型提供了潜在的治疗方法。然而，FOLR1也在肾和肺上皮中表达，因此对该疗法临床应用必须解决的毒性问题值得关注。此外，该平台可用于发现新的C/G治疗靶点以及扩展到其他致癌融合的研究。
参考文献：
Le Q, Hadland B, Smith JL, et al. CBFA2T3-GLIS2 model of pediatric acute megakaryoblastic leukemia identifies FOLR1 as a CAR T cell target. J Clin Invest. 2022;132(22):e157101. Published 2022 Nov 15. doi:10.1172/JCI157101
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