【综述】蛋白质组学在脂肪来源干细胞治疗糖尿病创面中的研究进展

一、蛋白质组学及其研究方法

1.在炎症反应中的研究：2013年，Krisp等 ^［ 8 ］ 利用液相色谱与串联质谱联用质谱技术，调查和比较了慢性DFU患者和普通烧伤患者渗出液中的蛋白组成差异。通过分析每个蛋白光谱数，揭示了188个在慢性创面中差异表达的蛋白。大多数的蛋白涉及炎症反应、血管再生和细胞凋亡的生物学过程。炎症反应激活的S100蛋白（主要是S100A8和S100A9）是高表达；基质金属蛋白酶中基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）1、MMP2和MMP8是高表达，其能促进胶原蛋白的降解和组织的破坏；具有抗血管增生活性的蛋白也是高表达，血管数目减少，不能向创面组织供应充足的营养，以致创面处细胞死亡，创面处坏疽的发生也加速了这种细胞死亡 ^［ 8 ］ 。Riaz等 ^［ 9 ］ 利用单向电泳和双向凝胶电泳的方法找到差异蛋白并平行进行质谱分析，结果发现与正常人相比，糖尿病患者血清中C反应蛋白增加872%。所以，Riaz等 ^［ 9 ］ 认为糖尿病患者C反应蛋白增加与糖尿病炎症的发生有关。在临床试验中，应用无标记定量质谱法对健康体检者、T2DM患者和DFU患者的血清进行检测分析，结果显示T2DM组和DFU组血清组织蛋白酶S（cathepsin S，CTSS）水平明显升高，而DFU组CTSS表达水平又显著高于T2DM组（ P<0.001） ^［ 10 ］ 。CTSS是脂肪组织的生物标志物，脂肪组织能够产生各类炎性因子，其在血液中的浓度会随着肥胖而逐渐上升，使机体处于低度炎症状态 ^［ 11 ］ 。而较高循环水平的CTSS与炎症活动的增加有关，并参与葡萄糖和胰岛素代谢的早期失调 ^［ 12 ］ 。在糖尿病创面中，巨噬细胞比较易极化成M1形式，从而释放大量的促炎因子。糖尿病炎症环境并非在出现创面后才形成，研究发现创面形成前，糖尿病小鼠的炎症标志物如诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase， iNOS）、白细胞介素-6（interleukin-6， IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）等的mRNA水平已经升高，提示了糖尿病个体的基本炎症水平较高 ^［ 13 ］ 。与健康小鼠相比，糖尿病小鼠全身的白三烯B4（leukotrienes B4，LTB4）水平均升高，实验表明，这可能是因为低胰岛素条件触发5-脂氧合酶（5-lipoxygenase，5-LO）催化生产LTB4，进而诱导全身性炎症引起的 ^［ 14 ］ 。

在炎症因子中，含NOD样受体（NOD-like receptor，NLR）家族PYRIN域蛋白3（NOD-like receptor family，pyrin domain containing 3，NLRP3）-白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）的通路得到广泛关注。NLRP3受到危险信号的刺激后，激活下游剪切修饰IL-1β前体，产生并释放参与介导炎症反应的成熟IL-1β。体外实验表明，高糖会诱导巨噬细胞中NLRP3和IL-1β表达，且使其显著增加 ^［ 15 ］ 。糖尿病小鼠的巨噬细胞中5-LO的表达增加，胰岛素治疗可降低糖尿病小鼠体内循环中LTB4的浓度以及巨噬细胞中信号传导子和转录活化子1的表达 ^［ 15 ］ 。核因子кB（nuclear factor kappa B，NF-кB）也是IL-1β介导的信号通路等相关细胞因子的主要靶点 ^［ 16 ］ 。糖尿病创面存在丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）-蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）通路的抑制，可能因此致细胞IL-6的表达明显高于非糖尿病创面 ^［ 16 ］ 。同源盒基因A3（homeobox A3，HOXA3）转录因子参与调节RELA原癌基因（RELA proto-oncogene，p65）/NF-кB水平和组蛋白乙酰转移酶（Moz-Ybf2/Sas3-Sas2-Tip60-1，MYST1/KAT8/MOF）和去乙酰化酶活性，进而抑制TNF启动子的乙酰化 ^［ 17 ］ 。TNF-α可以刺激MOF的表达，从而影响NF-кB信号通路介导的巨噬细胞炎症反应，这可以解释局部持续性高炎症环境的来源 ^［ 18 ］ 。适度的炎症反应可促进伤口愈合，但糖尿病患者由于皮肤创面过度的炎症反应，使伤口过渡到组织增殖期所需的时间延长，长期处于慢性炎症反应状态，进而影响创面愈合。

2.在氧化应激中的研究：20世纪末，有人曾指出1型糖尿病的发病机制之一是IL-1β诱导大量iNOS，产生大量的NO，破坏胰岛β细胞。在体外IL-1β作用下，通过二维电泳和质谱分析方法检测了Wistar Furth（W.F）大鼠胰岛细胞，结果显示，有57种蛋白质表达发生变化，其中有10种蛋白质在二维电泳上出现2~4个蛋白质点代表相同的蛋白，这表明这些蛋白质存在多种翻译后修饰的可能性 ^［ 16 ］ 。Sparre等 ^［ 19 ］ 用类似方法分析糖尿病大鼠发现，有14种蛋白质变化与上述结果是一致的。Sparre等 ^［ 19 ］ 将体外IL-1β作用下获得的大鼠胰岛细胞移植到大鼠体内，结果发现32种蛋白质表达存在差异，其中25种与上述体外实验结果一致。这表明虽然实验动物模型不同，但是上述的差异蛋白质表明β细胞凋亡存在着相似的机制。

在糖尿病创面中常伴有氧化与抗氧化的失衡，导致活性氧（reactive oxygen species，ROS）过量产生。Mirza等 ^［ 20 ］ 发现在糖尿病创面中氧化应激途径过度激活，导致NLRP3持续活化，促进IL-lβ释放；而抑制ROS将抑制NLRP3的活化，进而抑制创面炎症环境持续。Hozzein等 ^［ 21 ］ 证明糖尿病创面难以愈合可部分归因于ROS水平升高和抗氧化酶活性丧失。在DFU患者溃疡的过程中，过量ROS会减弱机体的抗氧化能力，破坏细胞外基质中的蛋白多糖，积累的晚期糖基化终末产物进一步使创面中的各种蛋白质糖基化，进而影响糖尿病患者的创面愈合，如 图1 。还有研究表明，由线粒体损伤引起的氧化应激是糖尿病溃疡的主要诱因。Zhang等 ^［ 22 ］ 利用相对和绝对定量标记与串联质谱联用，对糖尿病大鼠的线粒体蛋白质进行分析发现有11种线粒体蛋白质受到影响。在糖尿病患者创面愈合的组织重塑阶段，创面因低水平的细胞外基质抗氧化酶受到氧化应激的损伤。此外，细胞外基质重构可受到氧化信号调节的基质金属蛋白酶表达和高水平氧化还原的影响，进而使糖尿病患者皮肤伤口愈合缓慢 ^［ 23 ］ 。

图1 糖尿病创面愈合机制图

慢性创面可分为止血期、炎症期、增生期及重塑期四个连续的愈合过程。DFU创面因各种内源性和外源性因素的影响，导致伤口停留在愈合的某个阶段。有研究对ADSC外泌体进行蛋白质组学分析，共检测出1 185个蛋白质，对其进行京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析发现，ADSC外泌体与丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、非受体酪氨酸激酶-信号传导及转录激活蛋白（Janus kinases-signal transducers and activators of transcription，JAK-STAT）信号通路存在着明显相关性，从而参与组织损伤修复 ^［ 24 ］ 。最近的研究也证明，ADSC可用于成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞和角质形成细胞中，从而调节伤口炎症、增强其增殖和迁移、抑制细胞凋亡、促进血管新生和加速皮肤创面愈合，刺激创面皮肤再上皮化，促进创面的愈合及改善瘢痕的形成 ^{［ 25 , 26 ］} 。

1.ADSC促进创面的血管新生以及血管网的形成：创面的新生毛细血管网可以为创面提供生长所必需的环境，从而显著缩短伤口愈合所需的时间，提高创面愈合率。对从糖尿病下肢溃疡患者和健康人中获取的ADSC外泌体进行非标记定量蛋白质谱测序分析发现，筛选出来差异显著的31种蛋白中有29种蛋白下调和2种蛋白上调。下调蛋白有过氧化氢酶（catalase，CAT）、CD9分子、整合素α 2B（recombinant integrin alpha 2B，ITGA2B）、整合素β3（recombinant integrin beta 3，ITGB3）、酪氨酸3/色氨酸5单加氧酶激活蛋白ζ（tyrosine 3/tryptophan 5 monooxygenase activation protein zeta，YWHAZ）、多聚蛋白1（recombinant multimerin 1，MMRN1）、S100钙结合蛋白A9（S100 calcium binding protein A9，S100A9）、胰岛素样生长因子酸不稳定亚基（insulin like growth factor binding protein，acid labile subunitI，IGFALS）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、纤维胶凝蛋白2（recombinant Ficolin 2，FCN2）等；上调蛋白则为脂多糖结合蛋白（lipopolysaccharide binding protein，LBP）、免疫球蛋白λ变量（immunoglobulin lambda variable 3-1，IGLV3-1） ^［ 24 ］ 。基因本体论（gene ontology，GO）注释结果显示，差异表达蛋白的分子功能与酶抑制剂和活性肝素结合能力有关 ^［ 24 ］ ，对创面愈合起着重要作用，前者可降低多种酶促反应水平，加重组织缺血缺氧，降低损伤修复率，后者可减少创面感染和血栓形成 ^［ 27 ］ ，差异表达蛋白在细胞位置上的主要差异集中在血小板α颗粒和细胞外囊泡中。血小板α颗粒中存在纤维蛋白原（fibrinogen，Fg）、血管性血友病因子（recombinant von willebrand factor，vWF）、β-血小板球蛋白（β-thromboglobulin，β-TG）。其中，Fg与凝血、血栓形成密切相关 ^［ 28 ］ ；vWF是血管内皮细胞的重要标记物，在机体受损状况下，血管内皮细胞新生速度加快，进而促进创面愈合，由此推断在慢性创面中vWF的表达降低或活性改变；β-TG与血小板释放相关，主要影响凝血过程和脂质转运。而与其他外泌体相比，ADSC外泌体与脂质代谢、转运的关系更加紧密。KEGG富集分析表明，差异蛋白与磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B，PI3K-Akt）信号通路、胆固醇代谢通路、黏着斑信号通路相关，而下调蛋白ITGA2B、ITGB3则通过参与PI3K-Akt信号通路，在创伤的发生发展中起关键作用 ^［ 24 ］ 。

Planat-Benard等 ^［ 25 ］ 首次证实，脂肪来源谱系细胞和血管内皮细胞具有类似的前体细胞，有参与体内血管形成的潜能。Pu等 ^［ 26 ］ 将ADSC和外泌体注于缺血后再灌注损伤的皮瓣，相较于对照组，试验组中术后第5天的皮瓣存活率和毛细血管密度均获得显著的提高，从而证实ADSC和外泌体能促进血管生成，且该功能是通过信号转导因子和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）磷酸化途径使IL-6表达来实现的。Nie等 ^［ 29 ］ 的研究表明ADSC可促进血管因子VEGF、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）等的分泌，促进新生肉芽组织的血管生成，还可在特定诱导条件下分化为平滑肌细胞和血管内皮细胞，参与形成新生血管。ADSC还可作为辅助成分，与生长因子或其他生物材料一起使用，从而促进糖尿病患者受损周围血管的形成 ^［ 30 ］ 。

2.ADSC减轻创面炎性反应：当受到外界病原体入侵时，正常的机体将启动炎症反应防御机制，以便及时清除坏死组织、防止组织损伤继续扩展及促进组织修复。而糖尿病创面由于各种内源性和外源性因素的影响，使其停留在愈合的某个阶段，当糖尿病创面停滞在炎症期时，炎性细胞和炎症因子的高表达会导致蛋白水解加剧，从而抑制创面愈合由炎症期向下一阶段前进，致伤口迁延难愈。Wang等 ^［ 31 ］ 研究发现，间充质干细胞外泌体富含miRNA，可以保护受损组织，减轻炎症损伤，提高对组织的耐受性，在抑制炎症方面发挥关键作用。对ADSC和骨髓源性干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）外泌体进行非标记定量蛋白质组学（label free quantification，LFQ）分析 ^［ 32 ］ ，共筛选出768个蛋白，差异蛋白14个，其中5个蛋白在ADSC外泌体中高表达，如线粒体翻译起始因子（mitochondrial translational initiation factor，MTI）；9个蛋白在BMSC外泌体中高表达。通路分析显示，ADSC外泌体与抗炎反应等信号通路有关。通过Western blotting分析方法检测证实了MTI的高表达 ^［ 32 ］ 。MTI分子结构中含有丰富的半胱氨酸与金属巯基簇结构，能抑制炎症信号通路的激活，进而发挥抑制炎症反应的功能 ^［ 33 ］ 。自体ADSC也能减少糖尿病创面IL-1β、IL-18、血管细胞黏附因子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）、TNF-α等炎性细胞因子的繁殖 ^［ 29 ］ 。ADSC外泌体在被巨噬细胞吸收后，外泌体携带的活性信号转导与转录激活因子-3会上调精氨酸酶-1（arginase-1，ARG-1）的表达，使M1巨噬细胞向M2巨噬细胞极化 ^［ 34 ］ ，同时通过降低IL-6、TNF-α两种促炎基因浓度，升高IL-10抗炎基因和M2型巨噬细胞标志物ARG-1的表达水平，从而产生抗炎效应。ADSC还可以通过抑制自然杀伤细胞、T和B淋巴细胞增殖、抑制树突状细胞亚群的成熟及改变细胞因子的分泌等来降低免疫反应，在功能上起到促进糖尿病创面愈合的作用 ^［ 35 ］ 。

3.ADSC调节成纤维细胞的增殖及迁移：有研究通过对ADSC培养液的蛋白质组学分析共检测出569个因子 ^［ 36 ］ 。其中半乳糖凝集素-1、壳多糖酶3样蛋白1（chitinase-3-like protein 1，CHI3L1）和组织基质金属蛋白酶抑制剂1（tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP-1）可以调节角质形成细胞和成纤维细胞增殖迁移，半乳糖凝集素-1可以调节细胞生长与黏附和血管的生成，CHI3L1通过减轻炎症和细胞死亡对损伤起到保护作用，并通过促进M2型巨噬细胞的激活、成纤维细胞增殖和基质沉积，在修复阶段发挥促纤维化的作用 ^［ 37 ］ 。另外，脂肪干细胞培养液（adipose stem cell conditional culture medium，ADSC-CM）可通过TGF-β1促进胶原沉积，通过透明质酸合成酶1（hyaluronan synthase 1，HAS-1）和HAS-2的表达促进成纤维细胞合成透明质酸，使愈合过程中肉芽能加速形成 ^［ 38 ］ 。有学者用人脐带间充质干细胞外泌体治疗糖尿病鼠创面 ^［ 39 ］ ，使用串联质谱技术对小鼠肌肉组织行蛋白质组学定量分析，通过同位素标记定量质谱（tandem mass tag，TMT）蛋白质组学检测结果显示，试验组较于对照组有82种差异蛋白质，包括33个上调蛋白、49个下调蛋白，对33种上调蛋白进行分析发现，CD105为上调蛋白的一种。采用Western blotting和TMT蛋白质组学方法测定肌组织中CD105及外泌体中TGF-β1蛋白水平的表达，结果显示外泌体组CD105的表达水平较对照组明显升高，且外泌体中含细胞因子TGF-β1。通过免疫印迹法显示，其可能是由于外泌体中细胞因子TGF-β1与内皮细胞膜表面CD105/TPR-Ⅱ受体复合物结合，而激活下游信号，致使内皮细胞活化增殖、内皮间隙变窄、通透性降低和血管新生。

Jung等 ^［ 38 ］ 研究发现，TGF-β1是ADSC不可或缺的旁分泌介质，其决定了胶原蛋白和透明质酸的合成。研究表明，脂肪干细胞来源细胞外囊泡（adipose derived stem cell-derived extracellular vesicles，ADSC-EV）是通过ADSC的旁分泌作用分泌的，ADSC-EV可通过激活PI3K/AKT信号通路，促使纤维细胞增殖与迁移，增加创面胶原的沉积、加速创面愈合以及提高创面愈合质量水平 ^［ 40 ］ 。由于糖尿病患者处于高糖环境中，机体中基质与胶原蛋白的形成受到了影响，ADSC及其外泌体通过促进基质的沉积和胶原纤维的形成促进肉芽组织形成，还可通过细胞间的直接接触与旁分泌作用，促进和调节成纤维细胞的增殖和迁移，从而在创面愈合初期刺激胶原表达而加快糖尿病创面的愈合 ^［ 41 ］ 。

通过蛋白质组学研究发现，糖尿病创面中差异蛋白多涉及炎症反应，且常伴有氧化应激的过度激活，ROS过量产生，致使NLRP3持续活化，进一步导致TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子持续产生，使机体处于持续性高炎症环境状态中，从而影响创面的愈合。而ADSC可通过激活STAT3信号通路和促进VEGF、HGF等的分泌来促进血管新生，通过抑制炎症信号通路的激活来发挥抑制炎症反应的功能，可通过激活PI3K/AKT等信号通路，促使纤维细胞增殖与迁移，增加创面胶原的沉积，加速创面愈合等，更多的治疗机制还有待于进一步探索。

蛋白质组学是细胞功能在生物学中的体现，它试图比较不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同，并通过研究相关的蛋白质结构和功能来对蛋白质进行分类和鉴定。传统的蛋白质研究侧重于研究单一蛋白质，而蛋白质组学侧重于研究涉及特定生理或病理状态的所有蛋白质种类及其与周围环境的关系。目前，仅在RNA研究水平上还不能解决蛋白质复杂的翻译后的修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质构象和蛋白质间相互作用等问题，所以并不能全面代表蛋白质表达水平，这仍依赖于蛋白质组学技术直接对蛋白质的研究。蛋白质组学研究本质上是在细胞水平上对蛋白质进行大规模的平行分离和分析，因此同时需要大量蛋白质。因此高通量、高灵敏度和高准确的研究技术的发展仍是研究蛋白质组学的主要任务之一。经典的蛋白质组学技术（如传统的双向凝胶电泳）操作繁琐，且具有不稳定、低灵敏度等缺点，对低表达但又功能重要的蛋白质不易获取，所以发展可替代或补充传统技术的新方法成为目前最主要目标。如新型的荧光染色技术、二维色谱、微流芯片等新技术正逐步发展补充和取代蛋白质组学传统技术。为了确定和鉴定从蛋白质组学中分离出来的不明蛋白质，一些研究人员也在尝试通过生物信息学技术来探究和理解所获得数据的生物学意义。通过运用蛋白质组学技术，研究药物寻找其靶分子、了解疾病的代谢网络和细胞信号转导系统变化、找出疾病发展过程中的血浆疾病标记物等方法阻止疾病的发生发展，帮助人类战胜包括糖尿病在内的基因疾病。由蛋白质组学、生物信息学和基因组学等学科形成的系统生物学研究模式未来将可能成为探究人类生命科学的新前沿。