一、实验材料
1.实验动物：36只10~11周龄的雄性BKS-DB小鼠作为T2DM组（db/db），36只10~11周龄的雄性C57BL/6小鼠作为对照组（wt），均购自江苏集萃药康生物科技有限公司。小鼠饲养于华中科技大学同济医学院附属同济医院实验动物中心无特定病原体级实验室，室温维持在22~24 ℃，相对湿度60%，光暗周期为12 h∶12 h，分笼饲养（6只/笼），保持自由摄食和饮水，适应期均采用正常饮食。所有动物实验操作均由华中科技大学同济医学院附属同济医院实验动物伦理委员会根据《湖北省实验动物管理条例》和《华中科技大学实验动物伦理委员会章程》规定审批通过（审批号：TJH-202110025）。
2.实验试剂：放射免疫沉淀分析（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司；三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）购自武汉赛维尔生物科技有限公司；广谱蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、二喹啉甲酸测定（bicinchoninic acid assay，BCA）蛋白浓度测定试剂盒、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝胶制备试剂盒、超敏增强型化学发光试剂（enhanced chemiluminescence，ECL）、上样缓冲液购自武汉博士德生物工程有限公司；聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜购自美国Millipore公司；甲醇、多聚甲醛购自湖北省医药有限公司；小鼠源性Aβ1~42抗体购自英国Abcam公司；兔源性APP多克隆抗体、β位点APP裂解酶-1（β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme-1，BACE-1）多克隆抗体、APP以及测定胰岛素所用的酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；Aβ1~42、C肽ELISA试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司；小鼠源性甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）内参抗体购自武汉安特捷生物技术有限公司；山羊抗兔结合辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）二抗、HRP-山羊抗小鼠二抗购自美国Proteintech公司。
3.实验仪器：电泳仪、转膜仪（美国Bio-Rad公司）；正置光学显微镜（日本Olympus公司）；曝光仪（广州博鹭腾生物科技有限公司）；酶标仪（武汉艾维斯特科技有限公司）；石蜡切片机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；小鼠行为学仪器及监测软件（上海欣软有限公司）。
二、实验方法
1.动物分组：适应性喂养2周后，将36只对照组小鼠以及36只T2DM组小鼠通过简单随机化法分别分为6组：13周龄组、16周龄组、19周龄组、22周龄组、25周龄组、28周龄组。小鼠处死前记录其体重，处死后立即采集完整海马组织以及胰腺组织，-80 ℃保存。
2.血糖及血浆胰岛素测定：各组小鼠处死前由尾静脉采血，并用血糖仪检测血糖水平；同时心脏取血1 ml，离心后取血清，-20 ℃保存，采用胰岛素ELISA试剂盒检测小鼠胰岛素水平。
3.胰岛素抵抗指标：以稳态模型评估胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment of insulin resistance index，HOMA-IR）来评估胰岛素抵抗程度，HOMA-IR=空腹胰岛素（U/L）×空腹血糖（mmol/L）/22.5。
4.旷场实验：通过测定小鼠在正方形敞箱（45 cm×45 cm×45 cm）中的活动情况来评估其自主活动能力和焦虑状态。在测试之前，让小鼠适应安静明亮的房间，然后将小鼠放置于敞箱的中央，使其自由探索10 min，并用摄像机记录小鼠的活动，不同小鼠实验之间用75%的乙醇擦拭敞箱以排除气味的干扰，通过上海欣软行为学软件分析小鼠的活动总距离。
5.新物体识别实验：在旷场实验结束后的第1天用同样的敞箱进行，用于评估情境学习记忆能力。将外形一样的物体置于敞箱，首先让小鼠在敞箱中自由探索5 min。30 min后，用一个外形不同的新物体替代其中一个旧物体，再让小鼠自由探索5 min。用摄像机记录小鼠的运动轨迹，通过上海欣软行为学软件分析第2次实验中小鼠探索新物体的频率百分比，探索新物体的频率百分比=探索新物体的频率/（探索旧物体的频率+探索新物体的频率）×100%。
6.巴恩斯迷宫实验：实验在一个直径为1 m的圆盘上进行，圆盘周围有18个逃生口，其中只有一个是安全通道。实验分为13 d进行，前10天为训练日，将小鼠放在圆盘中间，让其自由活动，找到逃生口为训练终止，每次最多30 min；第11、12及13天为测定日，将小鼠再次放在圆盘中间，通过上海欣软行为学软件运动轨迹跟踪系统测定小鼠从此处找到安全洞前探索错误洞口的次数。
7.组织蛋白提取及蛋白浓度测定：（1）小鼠海马和胰腺组织取适量样后加生理盐水，匀浆器匀浆，4 ℃条件下，3 000×g离心10 min，弃上清；匀浆管内放入两个研磨珠，取小鼠海马和胰腺组织于管内，加入配制好的蛋白裂解液混合物，研磨仪中研磨2 min，使蛋白裂解充分。研磨结束后，4 ℃条件下，14 000×g离心20 min，吸取上清冻存。（2）蛋白质浓度测定：采用BCA法进行蛋白浓度测定，详细步骤根据BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行。
8. Western blotting法检测蛋白含量：每组取20 μg蛋白样品上样，SDS-PAGE分离后，转膜至PVDF膜。TBST洗涤缓冲液洗膜后用5%脱脂奶粉室温封闭1 h；封闭结束后再次TBST洗膜，加入APP抗体（1∶1 000）、BACE-1抗体（1∶1 000）、GAPDH抗体（1∶10 000）、4 ℃孵育过夜；TBST洗膜后，加入HRP-山羊抗兔二抗（1∶5 000）或山羊抗小鼠二抗（1∶5 000）孵育1 h；TBST再次洗膜后，将膜平铺于曝光板上，将配制好的ECL显影液均匀滴在膜上，曝光显影。显影成像，扫描条带，Image J进行灰度值分析。以GAPDH为内参，定量分析目标蛋白的相对表达量。
9.免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）分析法观察各组小鼠Aβ在胰腺和大脑组织的分布及表达情况：组织于4%多聚甲醛中固定后进行石蜡包埋，石蜡切片机切片后经脱蜡、水化和抗原修复后，加入10%山羊血清室温下孵育20 min进行封闭；封闭结束后，用抗Aβ1~42抗体（1∶200）、抗APP抗体（1∶300）、抗BACE-1抗体（1∶900）在4 ℃下进行免疫染色过夜；次日在室温复温后，TBST洗涤，加入二抗37 ℃下孵育45 min；再次TBST洗涤后，往切片上滴加显色剂；用苏木素进行复染，盐酸乙醇分化，返蓝液返蓝；干燥封片后，在显微镜下拍摄图像或扫描。
10. ELISA检测各组小鼠Aβ、APP以及BACE-1在胰腺和大脑组织的表达情况：详细步骤根据ELISA试剂盒说明书进行。
三、统计学分析
采用Image J软件对Western blotting条带和IHC结果进行定量分析，使用Graphpad Prism 8.0软件进行统计学分析和绘图。所有数值以均数±标准误表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。采用Spearman相关性分析法分析胰腺Aβ含量与HOMA-IR和胰岛素/胰岛素原比值之间的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。
一、各组小鼠在不同周龄时的体重、空腹血糖水平的比较在小鼠处死前测量其体重和空腹血糖，结果发现，与对照组相比，T2DM组小鼠在不同周龄的体重和空腹血糖水平均升高（均P<0.05）；并且随着年龄的增长，对照组及T2DM组小鼠的体重和血糖均逐渐升高（均P<0.05，图1）。图1 各组小鼠在不同周龄时的体重（A）、空腹血糖（B）的变化情况行为学实验结果显示，自19周开始，与对照组相比，T2DM组小鼠在旷场实验中运动总路程下降（P<0.05，图2A）、新物体探索实验中探索新物体的频率下降（P<0.05，图2B）、巴恩斯迷宫实验中在找到安全洞前探索错误洞的次数增加（P<0.05，图2C）。同时随着年龄的增长，T2DM小鼠的认知功能水平呈现出逐渐下降的趋势（P<0.05）。图2 行为学实验观察各组小鼠在不同周龄时的认知水平变化情况。A：旷场实验；B：新物体探索实验；C：巴恩斯迷宫实验三、各组小鼠在不同周龄大脑和胰腺中Aβ的分布及表达情况IHC结果显示，与对照组相比，T2DM组小鼠大脑海马（图3A，3B）以及胰腺（图3C，3D）中Aβ的沉积升高，并且随着病程的进展，T2DM组小鼠大脑海马区及胰腺胰岛Aβ沉积逐渐加重（P<0.05）。ELISA结果与免疫组化分析结果一致，与对照组小鼠相比，T2DM组小鼠大脑海马（图4A）以及胰腺（图4B）中Aβ的含量升高；并且T2DM小鼠大脑海马和胰腺组织中Aβ的含量随病程进展呈逐渐升高趋势（P<0.05）。图3 光学显微镜下观察各组小鼠在不同周龄时的大脑海马和胰腺Aβ的沉积情况。A：免疫组织化学染色观察各组小鼠海马组织Aβ沉积情况（标尺：200 μm）；B：各组小鼠海马组织Aβ沉积定量分析；C：免疫组织化学染色观察各组小鼠胰腺组织Aβ沉积情况（标尺：200 μm）；D：各组小鼠胰腺组织Aβ沉积定量分析图4 酶联免疫吸附测定法检测各组小鼠在不同周龄时大脑海马和胰腺组织中Aβ、APP和BACE-1的含量。A：各组小鼠海马组织Aβ含量情况；B：各组小鼠胰腺组织Aβ含量情况；C：各组小鼠海马组织APP含量情况；D：各组小鼠胰腺组织APP含量情况；E：各组小鼠海马组织BACE-1含量情况；F：各组小鼠胰腺组织BACE-1含量情况四、各组小鼠在不同周龄大脑和胰腺中APP及BACE-1的表达情况ELISA结果显示，与对照组小鼠相比，T2DM组小鼠大脑海马以及胰腺中APP（图4C，4D）和BACE-1（图4E，4F）的表达水平升高，并且T2DM小鼠大脑和胰腺组织中APP和BACE-1的表达水平随病程进展呈先升高后下降的趋势（P<0.05）。Western blotting的结果与ELISA结果一致（P<0.05，图5）。图5 Western blotting法检测各组小鼠在不同周龄时大脑海马（A）和胰腺（B）组织中APP、BACE-1蛋白的相对表达量五、各组小鼠在不同周龄时的胰岛功能情况及其与胰腺Aβ沉积的相关性评估与对照组小鼠相比，T2DM组不同周龄小鼠的空腹胰岛素水平（图6A）、HOMA-IR（图6B）升高（P<0.05）；自22周开始，与对照组小鼠相比，T2DM组小鼠的胰岛素/胰岛素原比值（图6C）升高、C肽水平（图6D）下降（P<0.05）。随着病程进展，T2DM组小鼠的胰岛功能水平逐渐下降，并且与逐渐增加的胰腺Aβ沉积具有相关性，其中，HOMA-IR和胰岛素/胰岛素原与胰腺Aβ沉积的Spearman相关系数分别为0.837 0和0.728 1（P<0.001，图6E，6F）。图6 各组小鼠在不同周龄时的胰岛功能情况及其与胰腺Aβ沉积的相关性评估。A：各组小鼠在不同周龄时血清中空腹胰岛素水平变化情况（每组6只小鼠）；B：各组小鼠在不同周龄时的HOMA-IR变化情况（每组6只小鼠）；C：各组小鼠在不同周龄时的胰岛素/胰岛素原比值变化情况（每组6只小鼠）；D：各组小鼠在不同周龄时血清中C肽水平变化情况（每组6只小鼠）；E：Spearman相关性分析法分析2型糖尿病组小鼠胰腺Aβ含量与HOMA-IR的相关性（36只小鼠）；F：Spearman相关性分析法分析2型糖尿病组小鼠胰腺Aβ含量与胰岛素/胰岛素原比值的相关性（36只小鼠）
多项研究表明，T2DM和AD之间存在很强的相关性［6, 7, 8］。在本研究中，随着T2DM病程的进展，我们发现与AD密切相关的Aβ在T2DM小鼠胰腺和大脑海马组织中的沉积情况以及表达水平呈逐渐升高的同步变化趋势。Aβ的产生主要是由APP在关键酶BACE-1的切割后产生［4］，因此本研究也观察了T2DM小鼠APP和BACE-1随病程进展表达水平的变化情况。结果显示，APP和BACE-1在胰腺和大脑海马组织的表达水平随病程进展呈先升高后下降的同步变化趋势。而Aβ与APP和BACE-1表达水平变化的不同可能是由于APP经过BACE-1以及γ-分泌酶切割后，产生的Aβ会在细胞外沉积形成不可逆的神经炎斑块［3, 4，9］。由于Aβ沉积的不可逆性，因此在本研究中当APP、BACE-1的表达水平在后期（25、28周）出现下降时，组织中Aβ的含量由于累积效应仍出现持续升高的表现。其次本研究还发现，随着病程的进展，T2DM小鼠的胰岛功能逐渐下降，并且与逐渐增加的胰腺Aβ沉积具有相关性。上述结果提示，胰腺中Aβ的沉积可能参与了T2DM的病程进展，胰腺中Aβ沉积同时可能是T2DM的病理特征之一。
T2DM的主要特点是胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能受损，导致血糖升高，同时也会影响体内的营养代谢，引起一系列代谢紊乱和病理生理变化，最终导致各种急慢性并发症的发生，如心脑血管疾病、肾脏疾病、眼病以及神经系统疾病等［10］。AD的临床特征是进行性认知功能下降和痴呆，病理学特征是形成含有Aβ的细胞外神经炎性斑块和由微管相关蛋白Tau组成的细胞内神经原纤维缠结［2，11, 12］。近年来，越来越多的证据表明T2DM和AD之间存在着紧密的关系［13, 14］。两种疾病具有许多共同的危险因素和发病机制，例如慢性炎症、胰岛素抵抗、代谢紊乱、氧化应激等［6］。研究表明，T2DM是痴呆症和迟发性AD的潜在危险因素［15, 16］。流行病学研究显示，糖尿病患者发生AD的风险是非糖尿病人群的1.36倍，在亚洲人群中则为1.62倍［17］。另外一项研究结果显示，与健康人群相比，T2DM患者的认知能力下降速度增加2倍［18］。并且Li等［19］的研究发现，糖尿病患者出现的认知能力下降与患者病程的进展以及高血糖水平相关，这与本研究中实验结果一致。
T2DM小鼠胰腺和脑Aβ、APP以及BACE-1的表达水平随病程进展呈现同步变化的趋势，其背后可能存在的机制可以从以下几个方面来解释：（1）T2DM的全身胰岛素抵抗与脑胰岛素抵抗有关，而脑胰岛素抵抗是AD的一个特征［20, 21］。中枢胰岛素抵抗以及T2DM一直伴随的慢性炎症状态会影响大脑中的胰岛素敏感性，最终导致Aβ积累，从而导致AD［22］。其次，有研究显示，外周Aβ竞争性地与外周胰岛素受体结合以及外周Aβ的沉积同样会导致胰岛素抵抗、高胰岛素血症的发生［23, 24］。胰岛素抵抗和相关的高胰岛素血症是解释糖尿病AD风险增加的机制［25］。（2）复杂的分子机制，如胰岛素和（或）胰岛素样生长因子-1（insulin like growth factor 1，IGF-1）信号传导可能将T2DM和AD联系起来［26］。有证据表明，胰岛素和（或）IGF-1向脑细胞信号的改变可能是AD中淀粉样蛋白积累的原因［27］。与（1）相似的是，本研究观察到了T2DM小鼠随病程进展出现的胰腺Aβ沉积逐渐增加与其逐渐下降的胰岛功能水平具有相关性。遗憾的是，本研究目前未能探索T2DM小鼠胰岛素和（或）IGF-1的水平变化与脑胰岛素抵抗和Aβ沉积之间的关系。
由于本研究属于初步的观察性研究，固然存在着一些局限性：（1）本研究只用了一种T2DM小鼠模型，并且只在13~28周龄间观察了Aβ沉积情况，不能完全反映T2DM真实的变化情况，在未来的研究中，我们会新增不同模型和周龄来完善实验；（2）本研究只初步观察到了T2DM小鼠胰腺大脑Aβ表达水平随病程进展存在同步变化的现象，还未能对其背后可能存在的机制进行深层次的探讨研究。
综上所述，T2DM小鼠胰腺和大脑组织Aβ随病程进展的表达水平存在同步变化的现象，并且T2DM小鼠胰腺中Aβ的沉积与其胰岛功能水平的下降有相关性，而这些现象背后存在的具体分子机制，还有待未来研究的探讨和解答。
参考文献略
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