一、主要材料
1.实验细胞：HAEC（#6100）购自美国ScienCell公司。
2.实验动物：6只6周龄载脂蛋白E基因敲除雄性小鼠购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，室温20~26 ℃，相对湿度40%~70%，自由饮食和饮水，12 h/12 h昼夜规律条件下饲养。本实验经江苏集萃药康实验动物使用及管理委员会审核批准，批准号为GPTAP20230217-4。
二、研究方法
1.细胞培养与分组：HAEC在含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素、1% EC生长因子的EC培养基（美国Sciencell公司）中常规培养，并置于37 ℃、5% CO 2培养箱中。将培养好的细胞分为如下几组。（1）细胞对照组：无特殊干预因素；（2）细胞AGE组：200 μg/ml的AGE孵育48 h；（3）细胞对照+阴性对照小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）组：50 nmol/L阴性对照siRNA转染细胞48 h后，在无特殊干预的EC培养基中孵育48 h；（4）细胞AGE+阴性对照siRNA组：50 nmol/L阴性对照siRNA转染细胞48 h后，在200 μg/ml的AGE中孵育48 h；（5）细胞AGE+FOXO3 siRNA组：50 nmol/L FOXO3 siRNA转染细胞48 h后，在200 μg/ml的AGE中孵育48 h；（6）细胞AGE+ METTL3 siRNA组：50 nmol/L METTL3 siRNA转染细胞48 h后，在200 μg/ml的AGE中孵育48 h。
2.高通量测序：首先提取总RNA，用脱氧核糖核酸酶去除样本中的DNA，然后在样本中加入含有寡核苷酸-dT的磁珠来富集信使RNA（messenger RNA，mRNA）。对mRNA进行片段化，然后将片段化后的mRNA分成2份。1份加入m6A抗体免疫磁珠，从而富集具有m6A修饰位点的RNA片段。1份直接构建常规的转录组测序文库。文库构建使用Illumina TrueSeq Stranded mRNA，质量控制使用Agilent BioAnalyzer 2100（美国安捷伦科技公司），文库定量使用KAPA文库定量试剂盒（美国KAPA生物系统公司）。测序过程由Illumina HiSeqX-ten（上海OE生物技术公司）完成。
3.数据处理和生物信息学分析：高通量测序产生的原始数据由fastp软件进行质量控制，以获得高质量的过滤后数据。利用Hisat2与参考基因组进行比较和分析，并使用Guitar R软件包和deepTools软件对基因组比较结果数据进行质量检查，验证甲基化RNA免疫沉淀测序（methylated RNA immunoprecipitation sequencing，MeRIP-Seq）实验的效率。差异峰由MeTDiff检测，阈值为 P≤0.05，log 2差异倍数≥0.58，并使用ChIPseeker进行注释。使用超几何分布检验对先前发现的峰和差异峰进行京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，以判定差异峰所在基因主要影响的通路。MEME和DREME用于识别峰序列中的模 体情况，Tomtom用于将这些模 体序列与已知的模 体数据库进行比较，利用已知的模 体对其进行注释
4. RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation，RIP）：刮取并收集细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗2次，4 ℃ 1 000转/min（德国，艾本德，5424 R）离心5 min后弃上清并收集细胞。根据RIP试剂盒（中国，Geneseed Biotech公司，No.0102）说明书进行RIP实验。将未使用抗体进行免疫沉淀的上清标记为阳性对照组（Input），用m6A抗体或免疫球蛋白G（IgG）抗体免疫沉淀RNA蛋白复合物，得到m6A免疫沉淀组（m6A IP）及IgG免疫沉淀组（IgG IP），再对其复合物进行洗脱及纯化得到RNA。将收集到的RNA逆转录，并通过实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-PCR）检测 FOXO3 mRNA相对表达量，通过2 -ΔCt（ΔCt=Ct IP-Ct Input）计算得到IP/Input比值。最终结果 FOXO3 mRNA的相对表达量（m6A IP/Input）表示 FOXO3 mRNA的m6A修饰水平，IgG IP/Input作为免疫沉淀阴性对照排除特异性结合带来的误差。
5.细胞转染：METTL3（stB0012383A）、FOXO3（stB0001142A）和阴性对照（siN0000001-1）siRNA均购自RiboBio公司，小干扰序列如下：si-METTL3序列CAAGTATGTTCACTATGAA，si-FOXO3序列GAGCTCTAGCTTCCCGTAT，si-NC序列TTCTCCGAACGTGTCACGT。转染试剂为HiPerFect转染试剂（德国，QIAGEN公司，No.301704）。在AGE处理前，用50 nmol/L siRNA转染HAEC 48 h。
6.流式细胞术检测细胞凋亡：按照膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-fluoresceine isothiocyanate，Annexin V-FITC）/氯化丙啶（propidium Iodide，PI）试剂盒（美国，BD公司，No.556547）操作说明书对HAEC进行染色，应用流式细胞仪（美国，安捷伦）检测细胞凋亡情况。
7.RT-PCR：按照Primescript RT试剂盒（日本，Takara公司，No.RR047A）的说明将RNA转化为cDNA。然后使用iTaq Universal SYBR Green混合液（美国，Bio-Rad公司，No.1725124）进行RT-PCR。所用引物序列如下： FOXO3上游引物5′-CTCTCTCCGCTCGAA GT-3′，下游引物5′-CCTTATCCTTGA AGTAGGGC-3′。
8.Western blotting法检测蛋白表达：使用全细胞裂解检测试剂盒（南京，KeyGEN公司，No.kgb5303-100）从HAEC中提取蛋白质。用蛋白浓度测定试剂盒（美国，赛默飞公司，No.23227）检测蛋白质浓度。每组取20 μg总蛋白，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，后转膜至聚偏氟乙烯膜（美国，Millipore公司，No.IPVH00010）。再用5%脱脂奶粉（中国，biosharp公司，No.BS102）在室温下孵育1 h。用相应一抗在4 ℃下孵育过夜。兔抗METTL3抗体（ab195352）、兔抗类甲基转移酶14（methyltransferase-like 14，METTL14）抗体（ab220030）、鼠抗α-酮戊二酸依赖性二氧酶（alpha-ketoglutarate dependent dioxygenase，FTO）抗体（ab92821）、兔抗YTH结构域包含蛋白1（YTH domain containing protein 1，YTHDC1）抗体（ab259990）、兔抗YTH结构域蛋白家族1（YTH N6-methyladenosine RNA binding protein 1，YTHDF1）抗体（ab252346）、兔抗YTH结构域蛋白家族2（YTH N6-methyladenosine RNA binding protein 2，YTHDF2）抗体（ab220163）、兔抗FOXO3a抗体（ab109629）、兔抗β肌动蛋白（β-actin）抗体（ab8226）均购自Abcam公司，抗体活化型半胱氨酸蛋白酶-3（cleaved-caspase-3）（A11021）购自爱博泰克生物公司。抗体β-actin使用浓度为1∶5 000，抗体cleaved-caspase-3使用浓度为1∶500，其他抗体使用浓度均为1∶1 000。第2天加入浓度为1∶5 000的辣根过氧化物酶标记二抗（中国，biosharp公司，No.BL003A/No.BL001A），室温下孵育1 h后，使用化学发光试剂盒（美国，Millipore公司，No.21274A2）检测阳性蛋白质信号带，并用生物成像系统对信号强度进行量化。
9.构建糖尿病动脉粥样硬化小鼠模型：通过随机数字表法将6周龄载脂蛋白E基因敲除雄性小鼠分为单纯动脉粥样硬化组和糖尿病动脉粥样硬化组，每组均为3只，使每组小鼠体重尽可能均一，适应性喂养3~5 d。糖尿病动脉粥样硬化组小鼠腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ），以55 mg/kg剂量连续注射5 d。第1次注射前溶剂适应3~5 d（给药期间每日称重），每次注射前禁食4 h（溶剂适应期不禁食）。单纯动脉粥样硬化组小鼠腹腔注射柠檬酸缓冲液，其余同处理。2组小鼠普通饮食饲喂至20周龄。于8、12、20周龄尾部采血，使用强生稳豪型血糖仪检测空腹（禁食5~6 h）血糖，糖尿病动脉粥样硬化组小鼠空腹血糖均≥11.1 mmol/L。
10.小鼠主动脉组织蛋白提取：取样的器械用75%的乙醇消毒，迅速采集主动脉斑块区域组织（时间控制在3~5 min内）将样本放入离心管中。在离心管中按每1 ml裂解液中加入50~100 mg样本的比例，加入预冷的蛋白解液（含蛋白酶抑制剂）。用组织均质仪或匀浆器将样本匀至无肉眼可见的块状物。将样本放置于冰上至少30 min（至少每隔10 min涡旋震荡1次），以使样本充分裂解。4 ℃离心，12 000转/min离心约25 min，将上清转移至1.5 ml离心管中，取适量蛋白上清，进行BCA蛋白定量，根据定量结果加入适量的上样缓冲液，100 ℃变性10 mim。
11.免疫荧光染色：将小鼠主动脉斑块组织包埋在OCT冰冻切片包埋剂（中国，索莱宝公司，No.4583）中，使用切片机以5 μm的厚度切片，并将其附着在载玻片上。冰冻切片常温复温，用4%多聚甲醛固定液（中国，碧云天公司，No.P0099）固定15 min，再用PBS浸洗3~5 min，重复3次，接着用0.5%Triton-X（中国，碧云天公司，No.ST795）室温孵育10 min，PBS浸洗3~5 min，重复3次，然后在含有10%山羊血清（中国，索莱宝公司，No.SP084）的PBS中封闭1 h。滴加用5%牛血清白蛋白（中国，碧云天公司，No.ST795）稀释的一抗，4 ℃过夜。抗体METTL3（ab195352）、FOXO3a（ab314007）均购自Abcam公司，稀释比例均为1∶200，血小板-内皮细胞黏附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31）（No.553370）购自美国BD公司，稀释比例为1∶100。一抗孵育过夜后用PBS浸洗3~5 min，重复3次，然后滴加稀释比例为1∶500的荧光标记二抗（美国，Invitrogen公司，No.A11077&A11008），室温避光孵育约2 h。接下来用PBS浸洗3~5 min，重复3次，再滴加适量的4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-Diamidino-2-phenylindole，DAPI）（中国，碧云天公司，No.C1002）室温孵育3 min，用PBS浸洗3~5 min，重复3次，然后加抗荧光淬灭封片剂（中国，碧云天公司，No.P0126）封片。
三、统计学分析
使用Graphpad Prism 8.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以![]()
表示，两组间比较采用两独立样本 t检验。 P<0.05为差异有统计学意义。
一、AGE诱导HAEC后的差异m6A修饰谱
与细胞对照组相比，细胞AGE组有1 105个m6A峰发生了变化（ P≤0.05，log 2差异倍数≥0.58），其中647个峰上调，458个峰下调（ 图1A ）。有显著变化的峰大部分位于其他外显子（39.73%），其余分布在3′UTR（35.29%）、5′UTR（20.00%）和第一外显子（4.98%）（ 图1B ）。KEGG通路分析表明，黏附连接、自噬、细胞衰老是细胞过程相关通路中富集度最高的；在环境信息处理相关通路中，富集最高的信号通路分别是刺猬、AMPK和FOXO（ 图1C ）。
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图1 晚期糖基化终末产物（AGE）诱导人主动脉内皮细胞后的差异N6-甲基腺苷（m6A）修饰谱。A：火山图，红点代表与细胞对照组相比，细胞AGE组上调的峰，绿点代表与细胞对照组相比，细胞AGE组下调的峰，灰点代表两组差异无统计学意义的峰；B：扇形图，展示了差异峰在各区域的分布比例；C：差异m6A修饰mRNA的京都基因与基因组百科全书通路分析
二、FOXO3参与AGE诱导的HAEC凋亡
与细胞对照组相比，细胞AGE组的m6A修饰显著升高（ P<0.001， 图2A ）。与单纯动脉粥样硬化小鼠相比，糖尿病动脉粥样硬化小鼠主动脉斑块区域FOXO3蛋白表达显著升高（ P<0.05， 图2B ），FOXO3与CD31共定位上升，表明主动脉斑块区域EC中FOXO3表达上调（ 图2C ）。与细胞对照组相比，细胞AGE组的FOXO3的蛋白表达显著升高（ P<0.05， 图2D ）。与细胞对照+阴性对照siRNA组相比，细胞AGE+阴性对照siRNA组的凋亡显著升高（ P<0.001， 图2E ），cleaved-caspase-3表达显著升高（ P<0.05， 图2F ）。与细胞AGE+阴性对照siRNA组相比，细胞AGE+ FOXO3 siRNA组的凋亡显著降低（ P<0.01， 图2E ），cleaved-caspase-3表达显著降低（ P<0.05， 图2F ）。
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图2 FOXO3参与AGE诱导的人主动脉内皮细胞（HAEC）凋亡。A：RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验检测各组细胞 FOXO3 mRNA的m6A修饰水平，利用针对m6A或非特异性结合蛋白的抗体对m6A修饰的 FOXO3 mRNA进行免疫沉淀，再通过实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测 FOXO3 mRNA的富集情况；B：单纯动脉粥样硬化小鼠和糖尿病动脉粥样硬化小鼠主动脉斑块区域FOXO3蛋白表达量；C：免疫荧光染色检测小鼠主动脉斑块区域FOXO3与CD31共定位表达情况，白色方框表示共定位的局部放大区域，箭所示为CD31、DAPI和FOXO3共定位；D：细胞对照组和细胞AGE组细胞FOXO3蛋白表达量的比较；E：流式细胞术检测细胞对照+阴性对照siRNA组、细胞AGE+阴性对照siRNA组和细胞AGE+ FOX03 SiRNA组的细胞凋亡情况及3组细胞凋亡情况的比较；F：细胞对照+阴性对照siRNA组、细胞AGE+阴性对照siRNA组和细胞AGE+ FOXO3 siRNA组细胞cleaved-caspase-3蛋白表达量的比较
三、糖尿病动脉粥样硬化小鼠主动脉斑块区域m6A调节因子的表达
Western blotting结果显示，与单纯动脉粥样硬化小鼠相比，糖尿病动脉粥样硬化组小鼠主动脉斑块区域METTL3和YTHDC1的蛋白表达均显著上调（ P<0.05），其余调控因子的表达在两组间差异均无统计学意义（ 图3A ）。免疫荧光结果显示，与单纯动脉粥样硬化小鼠相比，糖尿病动脉粥样硬化组小鼠主动脉斑块区域METTL3与CD31共定位上升，表明主动脉斑块区域EC中METTL3表达上调（ 图3B ）。
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图3 糖尿病动脉粥样硬化小鼠主动脉斑块区域N6-甲基腺苷（m6A）调节因子的表达。A：Western blotting检测单纯动脉粥样硬化小鼠和糖尿病动脉粥样硬化小鼠主动脉斑块区域m6A调节因子的蛋白表达量；B：免疫荧光染色检测小鼠主动脉斑块区域METTL3与CD31共定位表达情况，白色方框表示共定位的局部放大区域，箭所示为CD31、DAPI和METTL3共定位
四、METTL3促进 FOXO3 mRNA的m6A修饰并调控其表达，参与AGE诱导的HAEC凋亡
与细胞对照组相比，细胞AGE组的METTL3蛋白表达显著升高（ P<0.05， 图4A ）。与细胞AGE+阴性对照siRNA组相比，细胞AGE+ METTL3 siRNA组FOXO3的蛋白表达显著下降（ P<0.05， 图4B ），FOXO3的m6A修饰显著下降（ P<0.001， 图4C ）。与细胞对照+阴性对照siRNA组相比，细胞AGE+阴性对照siRNA组的凋亡显著升高（ P<0.001， 图2D ），cleaved-caspase-3的蛋白表达显著升高（ P<0.05， 图2E ）。与细胞AGE+阴性对照siRNA组相比，细胞AGE+ METTL3 siRNA组的凋亡显著降低（ P<0.01， 图2D ），cleaved-caspase-3的蛋白表达显著降低（ P<0.05， 图2E ）。可见，AGE通过METTL3促进 FOXO3 mRNA的m6A修饰并调控其表达升高，从而诱导HAEC凋亡。
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图4 METTL3促进 FOXO3 mRNA的m6A修饰并调控其表达，参与AGE诱导的HAEC凋亡。A：Western blotting法检测2组细胞METTL3蛋白表达量；B：各组细胞FOXO3和METTL3蛋白表达量；C：RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验检测各组细胞 FOXO3 mRNA的m6A修饰水平，利用针对m6A或非特异性结合蛋白的抗体对m6A修饰的 FOXO3 mRNA进行免疫沉淀，再通过实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测 FOXO3 mRNA的富集情况；D：流式细胞术检测各组细胞凋亡；E：各组细胞cleaved-caspase-3蛋白表达量
本研究结果显示AGE诱导的HAEC中m6A修饰发生了显著变化。在糖尿病动脉粥样硬化小鼠主动脉斑块区域EC中METTL3表达显著上调，且METTL3可通过促进 FOXO3 mRNA的m6A修饰并调控其表达，参与AGE诱导的HAEC凋亡。
细胞凋亡是一种常见的细胞程序性死亡方式，有研究证明高血糖通过促进活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生，从而参与糖尿病EC氧化应激和细胞凋亡过程 ［ 8 , 9 ］ 。FOXO信号通路是人体内最重要的信号通路之一，大量研究表明其参与糖尿病血管病变的发生发展。FOXO3参与调控高血糖糖尿病患者体内ROS的产生 ［ 10 ］ ，ROS会导致血管损伤 ［ 11 ］ 。我们之前的研究表明，FOXO1通过抑制自噬相关蛋白14的表达，破坏自噬体与溶酶体的融合，从而介导AGE诱导的EC自噬性凋亡 ［ 4 ］ 。本研究通过KEGG富集分析发现，m6A甲基化水平发生显著变化的mRNA主要富集在FOXO、凋亡等通路中，提示m6A修饰可能通过调控这些通路相关mRNA从而参与AGE诱导的HAEC损伤。
FOXO3是调控细胞凋亡等多种生理过程的关键因子。大量研究表明， FOXO3 mRNA通过m6A修饰调控其自身蛋白水平变化，从而参与多种生理过程。METTL14上调能促进 FOXO3 mRNA的m6A修饰，并通过影响其mRNA稳定性促进FOXO3蛋白表达，从而参与滋养层细胞的自噬和凋亡过程 ［ 12 ］ 。并且有研究表明，FOXO3可参与糖尿病EC功能障碍 ［ 13 ］ 。我们的研究结果显示，AGE通过促进 FOXO3 mRNA的m6A修饰及其蛋白表达从而参与诱导HAEC凋亡。
甲基转移酶负责催化RNA甲基化及m6A定位，主要由METTL3、METTL14、肾母细胞瘤1相关蛋白和病毒样m6A甲基转移酶相关蛋白组成 ［ 14 ］ 。其中METTL3是催化m6A修饰主要的甲基转移酶 ［ 15 ］ 。大量研究表明，METTL3参与EC的损伤过程。METTL3通过丝裂原活化蛋白激酶通路介导尼曼-皮克C1样1的mRNA高甲基化，并参与低密度脂蛋白诱导的人脐静脉EC功能障碍 ［ 16 ］ 。本研究结果显示，糖尿病能促进主动脉EC中METTL3表达升高，初步表明METTL3参与糖尿病主动脉EC损伤过程。
METTL3可调控 FOXO3 mRNA的m6A修饰，从而参与多种疾病的发生发展。在索拉非尼耐药的肝癌细胞中，METTL3表达下调并降低 FOXO3 mRNA的m6A修饰，以YTHDF1依赖的方式调控 FOXO3 mRNA的降解，从而促进肝癌细胞中自噬诱导的索拉非尼耐药 ［ 17 ］ 。我们的研究结果表明，METTL3通过促进 FOXO3 mRNA的m6A修饰并调控其表达，参与AGE诱导的HAEC凋亡。
本研究尚存在一定局限性。m6A修饰调控目的蛋白表达的主要作用机制是通过调控其相关mRNA的稳定性、剪切、核转位和翻译实现的 ［ 18 ］ 。为了完善AGE对FOXO3表达的具体调控机制，我们还需要通过RIP实验检测与FOXO3相互作用最显著的甲基化识别蛋白，并检测其对 FOXO3 mRNA的稳定性和翻译的影响，并确定具体的m6A修饰位点。本研究结果还需要通过动物模型和人体样本进一步验证。
综上，本研究发现AGE诱导的HAEC中m6A修饰发生了显著变化，METTL3通过促进 FOXO3 mRNA的m6A修饰并调控其表达，从而参与糖尿病诱导的血管EC凋亡。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
参考文献略
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