南方医科大学李振华教授团队《BAM》：对植物源性细胞外囊泡进行脂质组学分析，为潜在的抗癌疗法提供指导

摘要

植物源性细胞外囊泡（PEVs）一直被认为是纳米医学和药物输送系统的优质来源。然而，由于其在生物医学方面的应用不明确，甚至相互矛盾，阻碍了其临床转化。在此，作者团队对四种常用的 PEV 进行了全面的成分分析，以充分了解其功能性脂质含量并评估其潜在的治疗应用。脂质体分析表明，生姜衍生 EVs（GEVs）中存在细胞毒性姜酚和姜酚。随后进行的体外和体内研究证实，姜源性 EVs 具有显著的抑制肿瘤细胞和肿瘤生长的功效。转录组分析表明，GEVs 可调节细胞周期和 p53 信号通路，从而诱导癌细胞凋亡。补充蛋白质组分析提示了PEV研究中潜在的蛋白质标记物。这些发现凸显了多组学分析在阐明PEV的潜在治疗效果和推动基于PEV的疗法开发方面的价值。

该研究以题为“Lipidomic analysis of plant-derived extracellular vesicles for guidance of potential anti-cancer therapy”发表在Bioactive Materials上（DOI:10.1016/j.bioactmat.2024.12.001）。

目前源自哺乳动物的细胞外囊泡 (EVs) 被认为是下一代纳米医学的天然疗法和给药系统，在众多生物医学领域都具有相当大的应用潜力。然而，它们的临床转化面临着一些障碍，尤其是产量低和缺乏大规模生产技术。最近，植物源 EVs（PEVs）作为一种潜在的可持续替代品，已被用于研究治疗性 EVs 的规模化分离。这可以追溯到1967年，当时科学家首次在胡萝卜细胞培养物中观察并发现了细胞外囊泡的存在。然而，直到过去二十年，PEVs 的分离、表征和应用才被新兴研究所揭示。研究表明，PEVs 与哺乳动物来源的 EVs 具有相似的理化性质，包括形态、大小分布、表面电荷等。值得注意的是，PEVs 还含有生物大分子，包括蛋白质、脂类和其他代谢物。因此，PEVs 被认为是一种新型的天然纳米药物，其治疗效果继承了其原始来源。此外，由于 PEVs 是从可食用和药用植物中分离出来的，因此被认为对人类食用是安全和生物兼容的。因此，最近的研究集中于 PEVs 在治疗一系列疾病方面的治疗潜力，尤其是抗炎、抗氧化应激和抗癌方面的应用。此外，考虑到免疫原性、不良反应、生物稳定性和可扩展性等因素，PEVs 是合成纳米颗粒和哺乳动物衍生 EVs 作为药物输送系统的优越替代品。尽管 PEVs 在生物医学应用方面取得了显著成就，但其临床转化仍受到 PEV 早期研究严谨性混乱的严重制约。迄今为止，从同一来源分离出来的 PEV 被用于不同的生物医学应用。例如，研究表明柠檬衍生的 EVs（LEVs）具有抗氧化和抗炎作用。相反，其他研究表明，LEVs 可通过改善 ROS 水平或 TRAIL 刺激诱导细胞凋亡并抑制肿瘤生长。这些研究似乎相互矛盾。此外，从葡萄柚、生姜和芦荟皮中提取的 PEVs 已被证明可有效用于抗氧化生物医学应用。但值得注意的是，这些研究尚未对 PEV 的功效进行比较，也未对 PEV 的抗氧化利用进行优化。全面了解 PEV 的组成对于充分阐明和进一步评估其治疗潜力至关重要，因为其中的物质决定了其功能。最近的研究利用高通量测序技术鉴定了 PEV 中的多种小 RNA，从而增进了我们对 PEV 的 RNA 组成和潜在作用的了解。然而，PEVs的治疗潜力尚未得到充分发挥，部分原因是缺乏对 PEVs主要功能脂质成分的详细研究。此外，PEVs 缺乏合适可靠的标记物，也阻碍了它们的分离、分类和详细分析。因此，对 PEVs 进行脂质体和蛋白质组学分析至关重要，有助于加深我们对 PEVs 潜在生物和药理作用的了解，确定期待已久的 PEV 标记物，并促进预测和优化 PEVs 的潜在治疗应用

图1：PEVs 脂质组学用于潜在抗癌疗法的示意图。(a) 葡萄柚、生姜、柠檬和葡萄衍生 EVs 的脂质组学分析方案，以及在 GEVs 中鉴定出姜酚和 shogaols 的方案。(b) GEV-iRGDs 通过诱导癌细胞凋亡作用进行抗癌治疗的方案。

图2.PEVs 的分离和表征。(a）葡萄柚、生姜、柠檬和葡萄衍生 EVs 的分离程序图。(b) GFEVs、GEVs、LEVs 和 GPEVs 的代表性 TEM 图像。比例尺为 100 nm。(c) 通过纳米粒子跟踪分析确定的 GFEVs、GEVs、LEVs 和 GPEVs 的粒度分布。(d）GFEVs、GEVs、LEVs 和 GPEVs 的 Zeta 电位值（n = 3）。数据为平均值 ± SD。

图3.PEVs 的分离和表征。(a）葡萄柚、生姜、柠檬和葡萄衍生 EVs 的分离程序图。(b) GFEVs、GEVs、LEVs 和 GPEVs 的代表性 TEM 图像。比例尺为 100 nm。(c）通过纳米粒子跟踪分析确定的 GFEVs、GEVs、LEVs 和 GPEVs 的粒度分布。(d）GFEVs、GEVs、LEVs 和 GPEVs 的 Zeta 电位值（n = 3）。数据为平均值 ± SD。PEVs 的比较脂质体分析。(a）比较从 GFEVs、GEVs、LEVs 和 GPEVs（n = 3）中分离出的脂质体的主成分分析（PCA）。(b) 从 GFEVs、GEVs、LEVs 和 GPEVs 中分离出的已鉴定脂质种类的数量。(c) 层次聚类热图，说明从 GFEVs、GEVs、LEVs 和 GPEVs 中鉴定出的脂质种类的相对强度。(d）饼图显示从 GFEVs、GEVs、LEVs 和 GPEVs 中分离出的主要脂质类别的百分比，包括甘油脂类、鞘脂类、甾醇脂类、脂肪酰类、甘油磷脂和前醇脂类。(e）GFEVs、GEVs、LEVs 和 GPEVs 中前 10 类脂质的数量。(f) 维恩图揭示了在 GFEVs、GEVs、LEVs 和 GPEVs 中常见和唯一鉴定出的脂质种类。(g) 6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-肖戈酚、8-肖戈酚和 10-肖戈酚的化学结构。(h) 高效液相色谱（HPLC）分析，检测 GEVs 衍生脂质中是否含有 6-姜酮醇、8-姜酮醇、10-姜酮醇、6-肖高醇、8-肖高醇和 10-肖高醇。(i) 用 CCK-8 试验测定不同浓度（0、5、10、50、100、200 μM）的 6-姜酮醇、8-姜酮醇、10-姜酮醇、6-肖戈醇、8-肖戈醇和 10-肖戈醇培养 24 小时后 B16F10 细胞的相对存活率（n = 3）。数据为平均值 ± SD。 

图4.GEVs 对体外肿瘤细胞的抑制作用。(a) 不同浓度（0、108、109、1010/mL）的 PEVs 培养 24 小时后 B16F10 细胞的相对细胞活力，由 CCK-8 试验测定（n = 3）。(b）不同浓度（0、1、2.5、5、10 × 109/mL）的 GEV 培养 24 小时后 B16F10-Luc 细胞的 IVIS 生物发光成像。(c) 不同浓度（0、1、5、10 × 109/毫升）的 GEV 培养 24 小时后 B16F10 细胞的体外增殖研究。最初共播种 1000 个 B16F10 细胞，培养 7 d（n = 3）。(d) 不同浓度（0、1、5、10 × 109/毫升）的 GEV 预处理 24 小时后 B16F10 细胞集落形成的代表性图像。共 200 个 B16F10 细胞最初播种并培养 7 天。（e）在菌落形成试验中第 7 天确定的菌落数量（n = 3）。(f）CLSM 图像显示不同浓度（0、1、5、10×109/毫升）的 GEV 培养 24 小时后 B16F10 细胞的钙黄绿素 AM/PI 双染色。刻度线，150 μm。(g）流式细胞仪分析不同浓度（0、1、5、10 × 109/mL）的 GEV 培养 24 小时后 B16F10 细胞的凋亡情况。(h）B16F10 细胞凋亡率的量化结果（n = 3）。数据为平均值 ± SD。

图5.GEV-iRGDs 的肿瘤靶向特性。(a）GEV-iRGDs 的制备过程示意图。(b) GEVs 和 GEViRGDs 的 Zeta 电位值（n = 3）。(c) 流式细胞术分析，确定 B16F10 细胞在孵育 24 小时后对 GEVs 或 GEV-iRGDs 的细胞摄取情况（n = 3）。(d）B16F10 细胞对 GEVs 或 GEV-iRGDs 的细胞摄取定量结果（n = 3）。(e）CLSM 图像显示 B16F10 细胞在孵育 24 小时后对 GEVs 或 GEV-iRGDs 的细胞摄取。刻度线，20 μm。(f）静脉注射 GEVs 或 GEV-iRGDs 后 4、24 和 72 小时小鼠肿瘤和主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的活体成像（n = 每组 3 只小鼠）。(g）体内外小鼠肿瘤辐射效率的量化结果。(每组 3 只小鼠）。(h）CLSM 图像显示 GEVs 或 GEV-iRGDs 在小鼠肿瘤和肝组织中的生物分布。比例尺为 50 μm。数据为平均值 ± SD。

图6.GEV-iRGDs 的体内抗肿瘤作用。(a) 动物实验设计示意图。每只小鼠静脉注射 (b) PBS、(c) GEVs 或 (d) GEV-iRGDs 后的肿瘤体积变化（每组 6 只小鼠）。(e）不同组小鼠的平均相对肿瘤体积（每组 6 只小鼠）。(f）各组小鼠的肿瘤重量（每组 6 只小鼠）。(g）不同组小鼠在治疗期间的体重变化（n = 每组 6 只小鼠）。(h）不同治疗后小鼠肿瘤组织 H&E 染色的代表性图像。比例尺为 100 μm。(i）不同处理后小鼠肿瘤组织中 TUNEL 的 CLSM 图像。比例尺，100 μm。(j) 不同治疗后小鼠肿瘤组织中 Ki-67 的代表性 IHC 图像。比例尺，25 μm。数据为平均值 ± SD。

图7.治疗后ALI小鼠BALF中炎性细胞的转录组图谱揭示了潜在的治疗机制。a）纳米复合物处理的ALI小鼠中炎性细胞转录的改变。I- ALI+ PBS治疗组; II- ALI+ABR@ PLGA治疗组; III- ALI+SiH@ PLGA治疗组; IV- ALI+SiH/ABR/@ PLGA治疗组。B）ALI和SiH/ABR@ PLGA治疗的ALI小鼠中上调和下调的DEGs.c）GO项显示在SiH/ABR@PLGA处理下ALI小鼠中下调最多的途径。d）GSEA显著抑制了SiH/ABR@ PLGA处理的ALI小鼠的凋亡反应。e）GSEA突出了SiH/ABR@ PLGA处理的ALI小鼠中IL-1信号传导的显著抑制。f）通过转录组学分析揭示的SiH/ABR@PLGA的肺保护作用的潜在机制的简要总结。

图7.GEVs 的抗肿瘤机制研究。(a）比较对照细胞和经 GEVs 处理的 B16F10 细胞转录组（n = 3）的主成分分析（PCA）。(b）基于对照细胞和经 GEVs 处理的 B16F10 细胞转录组的皮尔逊相关性的样本聚类。(c）维恩图显示对照细胞和经 GEVs 处理的 B16F10 细胞的基因图谱。(d）火山图显示了经 GEV 处理的细胞与对照细胞中显著差异表达的基因。虚线表示对数折叠变化（FC）绝对值 > 1 和调整后 P < 0.05 的临界值（红点，上调基因；蓝点，下调基因）（n = 3）。(e）基因本体（GO）和（f）京都基因组百科全书（KEGG）对差异表达基因的富集分析。热图显示 GEV 处理过的细胞与对照细胞相比，通过 GO 分析确定的(g) 细胞周期和(h) 细胞凋亡过程正调控通路中候选基因的表达水平。(i) 热图显示了通过 KEGG 分析确定的 p53 信号通路中候选基因的表达水平，这些候选基因来自 GEV 处理过的细胞与对照细胞。(j）RNA 测序（RNA-seq）结果，比较 GEV 处理细胞与对照细胞中 Ccnd1、Mdm2、Ccne1 和 Cdkn1a 基因的表达水平。结果以每百万映射读数的每千基外显子片段（FPKM）表示（n = 3）。(k）定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）结果，比较 GEV 处理细胞与对照细胞中 Ccnd1、Mdm2、Ccne1 和 Cdkn1a 基因的表达水平（n = 3）。数据为平均值 ± SD。

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