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纳米酶催化治疗的效果受限于有限的酶活性和特异性。在本研究中，合成了一种负载单原子铈纳米酶（Ce SAs@NC）的氮掺杂碳材料，表现出肿瘤特异性和优异的多种酶模拟活性。与负载CeO2纳米颗粒的氮掺杂碳材料相比，Ce SAs@NC展现了优异的类过氧化物酶和类过氧化氢酶活性。Ce SAs@NC能够将细胞内的过氧化氢转化为具有细胞毒性的羟基自由基和氧气（O2），进一步转化为超氧自由基。这种级联酶反应不仅能缓解肿瘤的缺氧微环境，还能诱导肿瘤细胞的脂质过氧化和凋亡或坏死。温和的光热作用能够增强Ce SAs@NC的酶模拟活性，而不会诱导肿瘤细胞产生保护性的热休克蛋白。此外，Ce SAs@NC还能调节免疫环境，刺激M1型巨噬细胞触发免疫反应，从而抑制肿瘤增殖。得益于单原子尺寸效应、光热效应、多种酶模拟活性和免疫调节效应的结合，Ce SAs@NC平台在体内外均表现出肿瘤特异性、较低毒性副作用以及较高的治疗效果。该研究以题为“Cobalt ions-derived nanoenzyme array for endosseous neural network reconstruction and osseointegration ” 发表在Journal of the American Chemical Society上（DOI: 10.1021/jacs.4c13573）。
由于天然酶成本高、运行稳定性差、回收困难，可以模仿天然酶特性的纳米酶已成为天然酶的潜在替代品。由于其纳米结构，纳米酶具有高效催化、高稳定性、易于大规模生产和低成本等优点，已广泛应用于生物传感、抗菌、抗炎和催化治疗肿瘤和其他疾病。随着癌症患病率逐年增加，全球发病年龄向年轻人倾斜，最常用的治疗方法包括手术、放疗和化疗都无法满足临床需求，更不用说副作用了。因此，纳米酶催化疗法（NCT）是一种新兴的肿瘤治疗策略。肿瘤微环境（TME） 的特征是缺氧、酸性和内源性过氧化氢的高表达。安全无毒的纳米酶可以催化过表达的H2O2 产生活性氧（ROS），例如羟基自由基（•OH）、单线态氧（1O2）和超氧自由基（O2•-），并可进一步诱导肿瘤细胞凋亡或坏死，称为NCT。由于NCT过程高度依赖于肿瘤组织的特定微环境，因此这种治疗可以选择性地杀死肿瘤细胞，而不会对正常组织产生毒副作用。
纳米酶（例如，氧化锰（MnO2）、氧化铈（CeO2）、氧化钴（Co3O4）、氧化铁（Fe3 O4） 等）总是表现出多种酶样活性（例如，过氧化物（POD）、过氧化氢酶（CAT）、氧化酶（OD）），并且可以对 TME 产生反应，专门用于癌症治疗。CeO2是一种著名的纳米酶，由于其优异的化学稳定性、生物相容性、低成本和独特的催化性能，已广泛应用于与氧化应激相关的各种生物领域。由于其特有的电子结构，CeO2具有Ce3+ 和Ce4+的混合价态和丰富的氧空位，赋予它各种酶样催化活性，包括 POD样、CAT样、OD样、超氧化物歧化酶（SOD）样和磷酸酶样活性，在NCT中显示出巨大的潜力。CeO2的POD样和CAT样活性与 CeO2表面的Ce3+/Ce4+比率密切相关。当Ce3+/Ce4+比值增加时，POD样活性增加，而CAT样活性受到抑制。此外，CeO2的POD-like 活性在TME等酸性环境中显著提升，而CAT-like活性反而降低。除了pH值外，影响POD样酶活性的另一个关键因素是温度。跟踪酶促反应的温度是进一步增强纳米酶的POD样活性的有效手段。然而，CeO2纳米酶的酶活性和抗肿瘤性能受到其固有结构的限制。因此，CeO2纳米酶与其他纳米材料或分子结合形成多功能纳米平台，通过将 NCT与其他疗法相结合，如化学动力学疗法（CDT）、热疗疗法（HTT）、光动力疗法（PDT）等，实现可调节的多种酶样活性并增强抗肿瘤性能。光热疗法（PTT）是一种HTT，通常使用光热转换剂将光能转化为热疗，从而杀死癌细胞。但是PTT需要将肿瘤组织的温度升高到50°C 以上才能完全消除肿瘤，这不可避免地导致周围正常组织的热扩散损伤和病理变化，甚至刺激肿瘤细胞的自我保护。然而，除了PTT之外，光热转换功能还可用于控制肿瘤组织的温度，通过双重调节辐射持续时间和功率密度来实现最佳的纳米酶催化效率。温和的温度不仅可以使用于抗肿瘤治疗的光热增强NCT成真，还可以保证周围正常组织的安全。由于固有的结构缺陷，nano-CeO2表现出有限的催化活性和选择性，使其难以在疾病治疗中替代甚至超过天然酶。纳米酶的比表面积是影响酶催化活性的关键因素。当纳米酶的尺寸减小到原子团簇或单原子尺度时，它们的能级结构和电子结构将发生根本性的变化，催化活性和选择性将得到显著提高。单原子催化剂具有最大的原子利用率、原子分散的活性位点、特定的电子和能级结构、独特的金属-载体相互作用以及相同的配位环境。随着原子纳米技术的出现，单原子纳米酶的出现可能会弥合纳米酶和天然酶之间的差距。
在这项工作中，作者受原子纳米技术的启发，开发了载有Ce单原子纳米酶（Ce SAs@NC）的氮掺杂碳，用于通过温和的光热增强级联NCT治疗肿瘤。Ce SAs@NC 具有优异的POD类、CAT类和OXD类酶活性，远高于载有CeO2纳米颗粒的氮掺杂碳（CeO2 NPs@NC），这归功于原子级分散活性位点和高Ce3+ /Ce4+比率。一方面，Ce SAs@NC在TME中表现出增强的POD样酶活性，以催化内源性H2O2的分解以产生细胞毒性•OH。另一方面，Ce SAs@NC 表现出级联酶活性。首先催化内源性H2O2分解，通过CAT样酶活性产生O2，以减少缺氧环境，然后催化O2 转化为高细胞毒性O2•-通过 OXD 样酶活性进行癌症治疗。由于NC基体的光热转化能力，Ce SAs@NC在808nm近红外（NIR）光激发下的温度升高，从而进一步促进了抗肿瘤治疗的酶样活性。结合光热和 TME 响应酶样活性，Ce SAs@NC通过构建快速高效的温和光热增强 NCT平台，表现出具有肿瘤特异性的提升抗肿瘤性能。此外，Ce SAs@NC能够调节肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的表型，抑制如IL-4和IL-10等促进肿瘤生长的细胞因子的释放，同时释放抗肿瘤因子如TNF-α和iNOS，从而调节肿瘤免疫微环境。通过温和光热增强的纳米酶催化疗法（NCT）和免疫治疗，Ce SAs@NC通过调节肿瘤微环境（TME）中的活性氧（ROS）水平、改善缺氧环境以及调控免疫细胞表型，展现出显著的抗肿瘤效果。这使其成为一种极具前景的用于肿瘤抑制的纳米酶药物。
图1.示意图显示Ce SAs@NC的基本特征。(a) Ce SAs@NC的TEM 图像。(b)交流HAADF-STEM图像和相应的Ce SAs@NC元素图谱图像。(c)放大倍率下Ce SAs@NC的AC HAADF-STEM图像。(d) Ce SAs@NC和CeO2的Ce L3边XANES光谱。(e）Ce SAs@NC和CeO2 的Ce L3边傅立叶变换(FT) EXAFS光谱。(f) Ce SAs@NC和 (g) CeO2 样品的小波变换(WT)。(h) Ce SAs@NC相应的EXAFS R空间拟合曲线。
图2.Ce SAs@NC的类POD特性。(a) Ce SAs@NC的类酶活性示意图和检测类酶活性的方法。(b)在 HAc-NaAc缓冲液（pH = 5.5）中使用OPD探针检测类POD活性时不同组的紫外-可见吸收光谱和相应的数码照片（对照组：OPD (1mM) + H2O2 (1mM)；NC：NC：NC（400μg mL-1）+OPD（1mM）+ H2O2（1mM）；CeO2 NPs@NC：CeO2 NPs@NC（400μg mL-1）+ OPD（1mM）+ H2O2（1mM）；Ce SAs@NC：Ce SAs@NC（400μg mL-1）+ OPD（1mM）+ H2O2（1mM））。(c)在HAc-NaAc缓冲液（pH = 5.5）中使用TMB探针检测POD样活性时，不同组的紫外-可见吸收光谱和相应的数码照片（对照组：TMB（1mM）+ H2O2（1M））：TMB（1mM）+ H2O2（1mM）；NC：NC：NC（400μg mL-1+ TMB（1mM）+ H2O2（1mM）；CeO2 NPs@NC：CeO2 NPs@NC（400μg mL-1）+ TMB（1mM）+ H2O2（1mM）；Ce SAs@NC：Ce SAs@NC（400μg mL-1）+ TMB（1mM）+ H2O2（1mM））。(d) 以H2O2为底物的Ce SAs@NC 的Michaelis-Menten动力学分析和(e)Lineweaver-Burk图。(f) CeO2 NPs@NC和Ce SAs@NC在HAc-NaAc缓冲液（pH = 5.5）中的POD特异性活性比较。比活性（SA）定义为每毫克纳米酶的活性单位。(g）不同处理后DMPO捕获的-OH的ESR光谱。(h) 0 V时 H2O2还原成H2O反应的自由能图vs SHE及其相应的优化结构。
图3.Ce SAs@NC的类CAT、类OXD和光热特性。(a) H2O2在PBS（pH = 7.4）中经不同处理分解产生溶解氧（对照组：H2O2（100mM）；NC：NC：NC (400μg mL-1)+H2O2(100mM)；CeO2 NPs@NC：CeO2 NPs@NC (400μg mL-1)+H2O2(100mM)；Ce SAs@NC：Ce SAs@NC (400μg mL-1) +H2O2(100mM)。(b)以H2O2为底物，Ce SAs@NC和CeO2 NPs@NC类CAT活性的Michaelis-Menten动力学分析。(c) H2O2在PBS（pH = 7.4）中经不同处理后分解产生的O2（CeO2 NPs@NC：CeO2 NPs@NC(400μg mL-1)+H2O2(100 mM)；Ce SAs@NC：Ce SAs@NC(400μg mL-1)+H2O2(100mM)）。TMB（1 mM）；NC：NC: NC (400μg mL-1) + TMB (1mM)；CeO2 NPs@NC:CeO2NPs@NC(400μg mL-1)+TMB(1mM)；Ce SAs@NC: Ce SAs@NC (400μg mL-1) + TMB(1mM)）。(e）不同处理后DMPO 捕获的-OOH的ESR光谱。(f)以硫酸钛为探针，不同组的H2O2分解能力随时间变化的曲线（对照组：H2O2（1mM）；NC：NC (400μg mL-1) +H2O2(1mM)；CeO2 NPs@NC：CeO2 NPs@NC (400μg mL-1) +H2O2(1mM)；Ce SAs@NC：Ce SAs@NC (400μg mL-1) + H2O2(1 mM)）。(g)不同浓度的Ce SAs@NC溶液在808纳米近红外照射（1 W cm-2）下的温度变化曲线。(h) Ce SAs@NC（400μg mL-1）在808纳米近红外辐照（1W cm-2）下经过五个开关周期后的光热稳定性。(i) Ce SAs@NC溶液（400μg mL-1）在不同功率密度的808纳米近红外辐照下的红外热图像。
图4.Ce SAs@NC对4T1肿瘤细胞的抗肿瘤作用。在没有或有H2O2（100μM）的情况下，用不同浓度的Ce SAs@NC与或不与 808 纳米近红外照射（1 W cm-2，5分钟）一起孵育 24 小时后，4T1细胞在（a）中性和（b）酸性介质中的存活率。（c）4T1细胞在不同时间对罗丹明-B标记的Ce SAs@NC的吸收。刻度线=20 nm。酸性培养基中不同处理后4T1细胞内(d) ROS、(e) O2、(f) NO和(g) iNOS 活性的荧光图像以及相应的半定量统计分析。刻度线=100nm。(h）使用MDA检测法定量测量LPO。(i）细胞内LPO的荧光图像。刻度线= 50nm。(j)用AO染色法评估4T1细胞溶酶体完整性的荧光图像。缩放条=100nm。(k) 4T1细胞的JC-1分析。缩放条=50 nm。(l）4T1 细胞的活/死染色和（m）流式细胞分析。刻度线=200nm。Ce SAs@NC 的浓度为400μg mL-1，H2O2的浓度为100μM，808 nm近红外的功率密度和照射时间分别为1 W cm-2和5 min。
图5.体外巨噬细胞再极化。(a-d）流式细胞术分析不同处理下巨噬细胞中CD86和CD206的表达水平。RAW264.7细胞最初用IL-4处理，随后暴露于不同的处理。通过实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测抗肿瘤细胞细胞因子，即（e）TNF-α和（f）iNOS，以及促肿瘤细胞细胞因子，即（g）IL-10和（h）IL-4。
图6.Ce SAs@NC的体内温和光热增强NCT联合癌症治疗。(a)4T1肿瘤小鼠模型建立和治疗示意图。(b)激光组和Ce SAs@NC +激光组 4T1肿瘤小鼠在808 nm近红外照射（1 W cm-2）下不同时间间隔的红外热图像和(c)升温曲线。(d)小鼠在注射后5分钟和24 小时的荧光成像。(e)相对肿瘤体积增长曲线，(f)肿瘤组织的数码照片，(g)不同处理14 d后的最终肿瘤重量。(i）不同治疗后肿瘤小鼠的存活率（n = 5）。(j）不同处理14 d后小鼠的数码照片、肿瘤切片的H&E、TUNEL 和Ki67染色。比例尺=200μm。Ce SAs@NC的剂量为1.5 mg kg-1，808 nm近红外的照射时间和功率密度分别为10分钟和1 W cm-2。n=5，*p <0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。统计分析采用 t 检验。
图7.Ce SAs@NC治疗癌症的免疫机制。在不同治疗后，使用（a）M2生物标志物CD206和（c）M1生物标志物CD86对肿瘤组织进行免疫荧光染色，并通过ImageJ进一步量化（b，d）。n=3，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。用对照组和Ce SAs@NC样品处理的肿瘤组织的转录组图谱。(e）火山图显示了对照组和Ce SAs@NC 样品中基因表达的差异。(f）分层热图显示了3个独立的对照组和Ce SAs@NC样品中的差异表达模式。(g）气泡图显示了京都基因组百科全书（KEGG）对对照组和Ce SAs@NC样本中差异表达基因的通路富集分析。(h)对对照组和Ce SAs@NC样品中表达不同的基因进行了基因本体（GO）富集分析。
综上所述，作者团队开发了一种Ce SAs@NC系统，以响应通过光热增强NCT进行抗肿瘤治疗的TME。Ce SAs@NC具有优异的POD类、CAT类和OXD类酶活性，远高于CeO2 NPs@NC的活性，这得益于其原子级分散的活性位点和高Ce3+/Ce4+比值。Ce SAs@NC通过模拟纳米酶级联催化反应，将肿瘤组织器官组织中内源性过量表达的 H2O2转化为具有丰富细胞毒性的-OH和O2，引起肿瘤细胞脂质过氧化、线粒体损伤和溶酶体损伤，进一步诱导肿瘤细胞凋亡和肿瘤组织坏死。此外，由于Ce SAs@NC的光热转换能力，通过近红外激光照射，催化反应可以维持在最佳温度。通过结合光热效应，构建了一种快速高效的NCT平台，在体外和体内均取得了显著增强的抗肿瘤效果，同时避免了对正常组织的明显损伤。此外，Ce SAs@NC还能调节肿瘤组织微环境中巨噬细胞的表型，抑制促进肿瘤生长的细胞因子，释放抗肿瘤因子，通过改变肿瘤免疫微环境达到抗肿瘤效果。Ce SAs@NC通过雾化增强了纳米酶的催化活性，为光热增强肿瘤特异性纳米酶催化治疗与潜在免疫治疗相结合的抗肿瘤治疗提供了一种新策略。
论文链接（DOI）：
https://doi.org/10.1021/jacs.4c13573
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