牙周炎是一种由口腔细菌生物膜引起的牙周组织感染性疾病，以活性氧（ROS）积累和免疫微环境失衡为特征。多功能纳米酶利用其理化特性和酶活性，为治疗牙周炎提供了有前途的抗菌和抗炎策略。 特别是，普鲁士蓝纳米酶（PBzymes）由于其强大的催化活性、多样的抗氧化功能和高生物相容性而表现出优异的ROS控制能力。然而，传统高温合成方法的实际应用受到限制。本研究介绍了一类在室温下合成的金属工程PBzyme，其在温和温度下具有强大的抗氧化活性和优异的光热性能。一氧化氮 (NO) 气体疗法为针对牙周组织深层感染提供了有前景的策略。因此，通过原位负载方法将硝普钠引入PBzyme中以产生SPBzyme。SPBzyme释放的NO增强抗菌作用并克服与细菌生物膜相关的耐药性，从而产生温和的光热抗菌特性和协同抗氧化作用。 体外抗菌试验证明了SPBzyme 在温和温度条件和近红外光照射下具有卓越的功效。此外，SPBzyme 可有效减轻炎症，在牙周动物模型中具有积极的治疗作用。总体而言，温和的温度光热NO释放纳米酶疗法代表了一种治疗牙周炎的新方法。该研究以题为“Engineering Mild-Photothermal Responsive and NO Donor Prussian Blue Nanozymes Using Mild Synthesis for Inflammation Regulation and Bacterial Eradication in Periodontal Disease“发表在Advanced Materials上。
牙周病被认为是全球第六大流行病，与心血管疾病、脑血管疾病、阿尔茨海默病等多种全身性疾病密切相关。纳米酶因其显着的特性而受到广泛关注，包括纳米级尺寸、可定制的形状、多样化的化学性质、成本效益、强大的稳定性和生物相容性。最近的研究表明，纳米酶表现出与各种纳米酶相似的催化行为。促进氧化还原反应的酶。例如，PBzymes 已证明在过氧化氢酶 (CAT)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶 (SOD) 活性方面具有功效。有人提出，PBzymes的多功能酶特性源于不同形式丰富的多种氧化还原电位，从而实现高效的电子转移过程。此外，普鲁士蓝纳米酶（PBzymes）已被证明可以有效减少活性氧（细胞内ROS）水平。因此，PBzymes在检测和调节氧化还原微环境方面具有明显的优势。然而，现有研究强调了 PBzyme 的问题，例如高合成温度和成本管理挑战。光热疗法（PTT）因其卓越的组织穿透能力、对健康组织的影响最小、杀菌作用快速有效、抗菌谱广、且不产生细菌耐药性而在抗菌应用中越来越受到青睐。然而，生物膜的形成和维持阻碍了 PTT 中的热量散发，给牙周病治疗带来了挑战。使用纳米酶治疗牙周炎的单一治疗方法遇到了某些挑战。首先，需要对纳米酶进行精确控制，准确靶向发炎部位，防止其被口腔唾液冲走。此外，大多数纳米酶功能简单，单一酶活性不足以实现抗菌和抗炎治疗作用强调了开发多功能纳米酶对于增强牙周炎治疗的重要性。
一氧化氮（NO）在调节许多生理和病理过程中发挥着至关重要的作用。NO主要由一氧化氮合酶 (NOS) 产生，该酶使用 L-精氨酸作为底物。NOS分为三种类型：神经型 NOS (nNOS)、内皮型 NOS (eNOS)和诱导型NOS (iNOS)。在牙周炎中，NO 具有双重功能。 正常生理条件下，eNOS和nNOS产生的低水平NO参与信号转导途径和生理过程，如促进血管扩张、通过糖酵解途径调节骨合成代谢、协助牙周软组织修复和牙槽骨生长等重建。相反，在病理条件下，iNOS被斑块微生物激活，导致高浓度NO的释放，从而诱导细胞毒性作用并加剧炎症。NO 已表现出出色的抗菌功效和对抗细菌生物膜相关耐药性的能力。 因此，在用NO治疗牙周炎时，主要方法是通过NO递送达到抗菌和抗炎效果，而次要方法是通过iNOS抑制来降低NO浓度，以阻止炎症进展。研究证实，在外源性NO递送策略中，影响抗菌功效的关键因素是局部环境NO暴露的浓度和持续时间。 然而，牙周炎治疗中的一个重大挑战仍然是NO的有效负载和精确递送，因为其半衰期短且扩散距离有限，以响应病理微环境到病变部位。
在本研究中，作者优化了金属工程PBzymes在室温下的合成条件，构建了包含8种不同金属的工程PBzymes库，并筛选了具有强抗氧化活性和高光热性能的金属工程PBzymes。作者的研究表明，钌(Ru)掺杂的 PBzymes，包括 CAT、SOD、氮自由基清除和光热性能，表现出强大的抗氧化能力。接下来，将硝普钠(SNP)整合到优化的PBzyme 中，开发出SPBzyme，它可以在发炎的微环境中释放NO。全面的体外和体内研究表明，SPBzyme通过在细菌水平上的光热处理去除生物膜来有效对抗细菌，同时在细胞水平上表现出卓越的自由基清除和抗炎能力。此外，金属工程PBzyme库的构建显着丰富了可用纳米酶的多样性和数量。此外，通过优化合成工艺，成功开发了PBzyme的室温合成方法，大大简化了整个生产流程。重要的是，引入了一种新颖的纳米酶库筛选方法，为未来基于纳米酶的疗法提供了宝贵的指导。SPBzyme纳米平台显示出治疗牙周病和其他深部感染的巨大潜力（Scheme 1）。
Scheme1 .用于治疗牙周炎的基于普鲁士蓝的纳米酶库的开发和评估的示意图。
图 1. PBzymes的制备和表征。A)筛选PBzymes的筛选图。B)Fe/Co/Ni/Cu/Zn/Mn/Ce/Ru-PB纳米酶的TEM图像。刻度线=200 nm。C)Fe/Co/Ni/Cu/Zn/Mn/Ce/Ru-PB纳米酶的Zeta电位分析和 D)Fe/Co/Ni/Cu/Zn/Mn/Ce/Ru-PB纳米酶在ddH2O中的Zeta电位分析和D)水合粒度（n=3）。E)200 μg/mL的Fe/Co/Ni/Cu/Zn/Mn/Ce/Ru-PB 纳米酶在不同阶段（1 W/cm2，16 分钟）的温度升高曲线。
图 2. Fe/Co/Ni/Cu/Zn/Mn/Ce/Ru-PB 纳米酶的类酶活性表征。A) 金属工程PBzymes的类酶活性筛选示意图。B) Fe/Co/Ni/Cu/Zn/Mn/Ce/Ru-PB 纳米酶的 CAT 样活性。纵座标代表酶活性（U/mg）。C)Fe/Co/Ni/Cu/Zn/Mn/Ce/Ru-PB 纳米酶的 SOD 样活性。纵座标表示酶活性（U/mg）。D) Fe/Co/Ni/Cu/Zn/Mn/Ce/Ru-PB纳米酶的类POD活性。纵座标表示酶活性（U/mg）。E）Fe/Co/Ni/Cu/Zn/Mn/Ce/Ru-PB 纳米酶的 DPPH- 和 F）ABTS-+ 氮自由基清除能力。纵坐标代表抑制率（%）。G)描述Fe/Co/Ni/Cu/Zn/Mn/Ce/Ru-PB 纳米酶酶样活性的雷达图。
图 3. SPBzyme 的特征。A) SPBzyme 的 TEM 图像。刻度线 = 200 nm。B) SNP、PBzyme 和 SPBzyme 的傅立叶变换红外光谱分析。C) SPBzyme 的 Ru 轨道的高分辨率 XPS 光谱。D)PBzyme 和 SPBzyme 的 XRD 分析。E) 在 808 纳米激光（100 微克/毫升，1 瓦/平方厘米）下，PBzyme 和 SPBzyme 在三个近红外光照射周期中的升温和冷却曲线。F) PBzyme 和 SPBzyme 的 SOD 抑制率曲线。G) CAT 活性的理论计算。H) SOD 活性的理论计算。I) PBzyme 和 SPBzyme 存在时产生的 O2。J) CAT 和 SOD 活性机理图。K) PBzyme 和 SPBzyme 清除 ABTS-+ 氮自由基能力的验证。L) 在 H2O2 模拟的炎症微环境中，不同浓度（25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL 和 667 μg/mL）的 PBzyme 和 SPBzyme 在 60 分钟内持续释放 NO。M）在（L）的基础上增加照射（1 W/cm2）条件下，SPBzyme（100 μg/mL）的 NO 释放浓度。N) 验证 PBzyme 和 SPBzyme 清除 DPPH-氮自由基的能力。
图 4. PBzyme 和 SPBzyme 的生物安全性和抗氧化能力。A) 用浓度为 25、50、75、150 和 200 μg/mL 的 PBzyme 和 SPBzyme 培养的表皮生长因子的活力。B) 使用 25 - 200 μg/mL 不同浓度的 PBzyme 或 SPBzyme 进行预保护或非保护后，用 40 μMH2O2 处理的 HGFs 的活力；****P < 0.0001；n = 3。数据为平均值 ± SD。P 值通过单因素方差分析和 Tukey 后检验计算得出。C) 用DCFH-DA 强度测定未处理的 HGFs 和用不同浓度的 PBzyme 或 SPBzyme 处理并与 30 μg/mL LPS 培养的 HGFs 细胞内 ROS 水平。****P < 0.0001. n = 3。数据为平均值 ± SD。P 值通过单因素方差分析和 Tukey 后检验计算。D) 流式细胞术分析用对照组、LPS、PBzyme 或 SPBzyme（100 μg/mL）预处理的 Raw264.7 细胞中的 ROS 水平。培养 12 小时后，用 DCFH-DA 对细胞进行染色。实验进行三次，结果相似。刻度线： 50 μm。E) 通过 JC-1 探针对未处理、PBzyme 处理或 SPBzyme 处理的 Raw264.7 细胞与 30 μg/mL LPS 培养的线粒体膜电位进行分析。缩放条 = 60 μm。
图 5. 含或不含近红外的 PBzyme 和 SPBzyme 对 F. nucleatum 生物膜的抗菌效果。A) 样品制备、生物膜形成和处理的实验方案示意图。用 BioRender.com 制作。B) 在不同处理（同等药物浓度）后，菌核病 F. 的菌落形成菌落数（CFU）。C) F. nucleatum 生物膜的 CFU 计数。****P < 0.0001. n = 3。数据为平均值 ± SD。P 值通过单因素方差分析和 Tukey 后检验计算得出。D) 不同处理（同等药物浓度）后 F. nucleatum 的代表性 SEM 图像。缩放条 = 5 μm（n = 3）。
图 6. PBzyme 和 SPBzyme 在有或没有近红外的情况下对生物膜的形成和建立的抗菌效果（F. nucleatum）。A、B）核酸梭菌（F. nucleatum）已形成和已建立的生物膜（死菌，红色染色；活菌，绿色染色）的代表性 3D 构建和活/死合并图像。缩放条 = 100 μm。C) F. nucleatum 在生物膜形成过程中的细菌存活率。D) F. nucleatum 形成生物膜的平均厚度。E) 已形成生物膜的 F. nucleatum 的细菌存活率。F) F. nucleatum 已建生物膜的平均厚度。数据为平均值 ± SD。P 值通过单因素方差分析和 Tukey 后检验计算。**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。
图 7. 评估 PBzyme 和 SPBzyme 在体内对牙周炎的治疗效果。A) 实验方法示意图。用 BioRender.com 制作。B) 显示牙周炎建模过程中钢丝固定在第二磨牙上的照片。C) 使用 PBzyme 和 SPBzyme 治疗牙周炎后用 880 纳米激光照射的照片。D) 近红外照射（880 纳米，1 瓦/平方厘米，5 分钟）下具有代表性的实时热温度曲线。E) 近红外照射下 (D) 的相应热图像。F) 通过微型计算机断层扫描获得的上颌第一磨牙区域的三维图像。红色虚线表示 CEJ 与 ABC 之间的距离，以反映牙槽骨损失。带红色虚线的圆圈表示进行骨小梁分析的区域。比例尺 = 1 毫米。G) 第 3 天对 CEJ-ABC 间距的定量测量。H) 第 3 天牙槽骨的 BV/TV 测量值。G) 和 H) 中的数据为平均值 ± SD。P 值通过单因素方差分析和 Tukey 后检验计算。* P < 0.05，***P < 0.001，****P < 0.0001，n = 3。
图 8. 体内 PBzyme 和 SPBzyme 抗炎效果的组织形态学评估。A, B) 第 3 天和第 7 天不同处理后 H&E 染色牙周组织的代表性图像。红色箭头表示 IL-1β 和 TNF-α阳性区域。C,D) 第3天通过 IHC 染色对 C) TNF-α
和 D) IL-1β 阳性细胞的定量。*P < 0.05，n = 3。E，F) 第 7 天通过 IHC 染色对 E) TNF-α和 F) IL-1β 阳性细胞进行定量。数据为平均值 ± SD。P 值通过单因素方差分析和 Tukey's后检验。***p < 0.001，****p < 0.0001。
这项研究旨在通过采用室温合成方法改进PBzymes的传统合成技术。值得注意的是，作者开发了一个用八种不同金属工程化的PBzymes库。通过筛选，鉴定出具有优异氧化应激能力的PBzyme变体。作者优化的PBzyme设计增强了炎症微环境中的光热反应，以释放NO。这种PTT/气体治疗有效地对抗了与牙周病相关的炎症和生物膜。光热和NO气体联合治疗在根除牙周细菌和抑制致病生物膜的发展方面显示出显著的疗效。此外，产生NO的近红外响应SPBzyme能够分散和消除完全发育的生物膜，导致约4个对数CFU的减少。抗菌药物通过有效消除细菌生物膜和增强抗炎反应，在治疗牙周炎方面发挥着至关重要的作用。重要的是，NO的排放不会影响纳米酶去除ROS的能力。在体外和体内研究中，SPBzyme表现出优异的抗氧化特性，可防止生物膜形成，破坏完全形成的生物膜，并减少炎症反应。这项研究通过生物膜根除和炎症调节为牙周病的临床管理提供了新启示。
论文链接（DOI）：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adma.202409840
申明：本微信号转发内容仅做学术交流使用，不作为商业用途，也不代表支持或赞同其观点，如涉及知识产权保护问题或其他方面的问题请及时联系小编，我们会尽快协调处理。本微信号原创文章版权归本微信号所有，欢迎分享到朋友圈等非媒体上。
联系小编可免费投稿推送，本公众号另建有纳米医学实名学术交流群，请备注姓名+单位+研究方向添加下方微信号。
往期推荐：同济大学材料学院杜建忠教授团队：多酚体喷雾剂治疗光催化诱导代谢干扰的抗生素耐药菌感染伤口
点击“阅读原文”，通往论文原文
「ENDING」
投稿微信｜nanomedicine1
投稿邮箱｜xianwenwang@126.com
关注纳米医学进展
了解纳米医学前沿
长按二维码私信投稿
