中南大学湘雅医院夏晓波教授《Advanced Science》：自组装缺氧和活性氧双反应纳米前药作为青光眼治疗的新途径

摘要

青光眼是一种以视网膜神经节细胞（RGC）死亡为特征的不可逆致盲眼病。研究表明，保护线粒体、激活CaMKII/CREB信号通路可以有效保护RGC和轴突。 然而，目前的治疗效果往往不尽如人意，青光眼的发病机制有待进一步阐明。 在该研究中，首先设计了一种 ROS 响应的双药物偶联物（OLN 单体），它同时结合烟酰胺和油酸。 该共轭物通过多个胶束的聚集自组装成纳米颗粒（uhOLN-NPs），并具有ROS清除能力。 然后，设计了一种具有缺氧响应功能的聚合物，将uhOLN-NPs封装形成具有缺氧和ROS响应的纳米颗粒（HOLN-NPs）。在 RGC 缺氧下，HOLN-NPs 的偶氮键断裂并释放 uhOLN-NPs。同时，在高ROS条件下，硫酮键断裂，导致纳米前药解离。释放的烟酰胺和油酸共同清除ROS并激活CaMKII/CREB途径，保护RGC中的线粒体。HOLN-NPs 对谷氨酸青光眼模型中的 R28 细胞表现出显着优越的保护作用。HOLN-NPs在视网膜RGC中的积累导致体内RGC细胞凋亡和轴突损伤的显着抑制。 值得注意的是，HOLN-NPs 为神经退行性疾病患者提供了一种新的治疗方法。该研究以题为”Self-Assembly Hypoxic and ROS Dual Response Nano Prodrug as a New Therapeutic Approach for Glaucoma Treatments” 发表在Advanced Science 上。

视网膜神经节细胞（RGC）的死亡和轴突损伤是青光眼的病理生理标志，它们将视觉信息从视网膜传递到大脑，它们的损伤和死亡导致严重的视觉障碍。目前，青光眼的治疗方法主要围绕通过各种药物、激光治疗或手术干预来管理眼内压，以减缓其进展。然而，这些治疗的有效性仍然有限，RGC的持续下降和死亡最终导致一些青光眼患者失明。同时，临床上尝试通过口服或静脉注射神经保护药物。然而，这种方法也面临挑战，如由于身体代谢和血眼屏障，到达眼睛的药物量有限。此前有研究认为氧化应激诱导的损伤是RGC死亡的一个关键因素。过量的活性氧（ROS）积累不仅触发线粒体双层膜孔的开启，还导致钙离子、细胞色素C（Cyt C）、凋亡诱导因子（AIF）的释放，随后通过caspase 9激活caspase 3/6/7。此外，线粒体的电子传递链可以被解耦，导致三磷酸腺苷（ATP）产量下调，促凋亡蛋白BCL2相关X（Bax）表达上调，最终导致线粒体外膜破裂和细胞凋亡。因此，有效清除ROS和保护线粒体可能是青光眼中神经保护的关键策略。烟酰胺（Nico）是维生素B3的酰胺形式， Nico不仅能通过消耗细胞内ROS抑制异常线粒体的形成，还可通过下调Cyt C水平和抑制聚ADP-核糖聚合酶（PARP）和磷酸化组蛋白H2AX（γ-H2AX）的表达来保护RGC免受损伤。油酸（OA）是一种在各种植物和动物脂质中天然存在的脂肪酸。它具有强大的抗氧化活性，是钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）的激动剂，可以通过清除细胞内ROS和激活CaMKII/CREB信号通路来保护神经元。最近的研究表明，CaMKII/CREB信号通路的激活不仅有效保护RGC细胞体和轴突免受损伤，还保护RGC轴突的远端投射，从而保护从视网膜到视觉皮层的视觉功能。

研究概况

该研究为Nico和OA设计了一个双重缺氧和ROS响应的纳米药物系统，可以注射到眼睛中以保护RGC。纳米药物（HNLO-NPs）是通过自组装一个具有硫酮键的聚合物而创建的，使其能够响应ROS并具有清除功能。然后，它被另一个具有缺氧响应特性的聚合物包裹。该研究在三种小鼠模型（mice^NMDA、mice^ONC和mice^IR）中评估了HNLO-NPs，这些模型复制了青光眼RGCs损伤的病理生理特征，包括谷氨酸兴奋性毒性、视神经挤压和缺血再灌注。在RGCs的缺氧环境中，HOLN-NPs的偶氮键断裂并释放uhOLN-NPs。此外，在RGCs中过量的ROS触发uhOLN-NPs中的硫酮键断裂，导致聚合物解离、ROS消耗以及Nico和OA的释放。Nico的释放有效地保护了线粒体并减少了细胞内ROS，从而抑制了RGCs的凋亡。同时，OA激活了CaMKII/CREB信号通路，防止了RGC凋亡和轴突损伤，同时消耗了细胞内ROS。综上所述，Nico和OA通过硫酮键结合，通过自组装和多胶束聚集形成ROS响应的uhOLN-NPs。此外，在低氧响应性聚合物P1涂层后，HOLN-NPs出现，提供线粒体保护和CaMKII/CREB通路激活。该方法为神经保护提供了一种新的策略。

图1.抑制青光眼RGC凋亡和轴突损伤的HOLN-NPs示意图。首先，在青光眼病变的损伤过程中，HOLN-NPs被缺氧激活，偶氮键打开释放uhOLN-NPs。其次，在ROS的刺激下OLN-NPs的巯基键打开，在清除活性氧的同时释放Nico和OA。第三，Nico通过Cyt C/PARP途径抑制RGC凋亡。最后，OA作为p-CaMKII激动剂通过激活CaMKII/CREB通路保护RGC免受凋亡和轴突损伤。

图2. HOLN-NPs的特征、缺氧响应性和清除ROS的能力。A-C）HOLN-NPs、HOLN-NPs + H₂O₂和HOLN-NPs + Na₂S₂O₄的代表性透射电子显微镜（TEM）图像。D,E）HOLN-NPs、HOLN-NPs + H₂O₂和HOLN-NPs + Na₂S₂O₄的流体动力学直径通过动态光散射（DLS）测量。F）HOLN-NPs、HOLN-NPs + H₂O₂和HOLN-NPs + Na₂S₂O₄的zeta电位通过DLS测量。G）HOLN-NPs在不同时间点清除H₂O₂。H）HOLN-NPs在6小时后不同浓度下清除H₂O₂。I,J）HOLN-NPs在不同时间点清除·ABTS⁺。K）HPLC分析1 mM H₂O₂触发的Nico和OA在不同时间点的释放。L）LTQ-MS结果表明Nico从OLN单体在1 mM H₂O₂存在下释放。

图3. 体外对HOLN-NPs的细胞内摄取、活性氧清除和凋亡抑制。A）A) R28细胞中HOLN-NPs的细胞内摄取、随后的活性氧清除和凋亡抑制的示意图。B）R28细胞用HOLN-NPs@Cy5.5处理0, 1, 4, 和7小时的代表性共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像。细胞核被DAPI（蓝色）染色。红色荧光来自Cy5.5（红色）。细胞骨架被Actin-Tracker Green-488（绿色）染色。C,D）流式细胞仪分析HOLN-NPs@Cy5.5在0, 1, 4, 和7小时的细胞内摄取。E,F）通过DCFH-DA检测Nico、OA、单体和HOLN-NPs处理的R28^Glu细胞中ROS的流式细胞仪分析。G）通过CCK-8测定Nico、OA、单体和HOLN-NPs在不同浓度下对R28^Glu细胞的体外细胞活力。H,I）CLSM图像显示R28^Glu经Nico、OA、N+O和HOLN-NPs处理24小时后，分别用Calcein-AM（绿色）和PI（红色）染色。

图4. HOLN-NPs对线粒体膜电位、细胞周期和凋亡的影响。A）HOLN-NPs对R28^Glu细胞线粒体膜电位、细胞周期和凋亡影响的示意图。B-D）用JC-1荧光探针染色的R28^Glu经Nico、OA、N+O和HOLN-NPs处理24小时的代表性CLSM图像。E,F）通过流式细胞仪检测用JC-1荧光探针染色的R28^Glu经Nico、OA、N+O和HOLN-NPs处理24小时的线粒体膜电位。G,H）经Nico、OA、N+O和HOLN-NPs处理的R28^Glu的细胞周期。I,J）通过Annexin V-FITC和PI双重染色测定不同处理组R28^Glu的凋亡水平的流式细胞仪分析。

图5.HOLN-NPs能够激活CaMKII/CREB信号通路。A）HOLN-NPs对R28^Glu细胞中p-CaMKII/p-CREB信号通路影响的示意图。B）不同IF处理R28^Glu中p-CaMKII的表达。C）不同处理组R28^Glu中p-CaMKII的相对像元强度。D）不同IF处理R28^Glu中p-CREB的表达。E）不同处理R28^Glu中p-CREB的相对像元强度。F）不同IF处理R28^Glu中γ-H2AX的表达情况。G）不同处理组R28^Glu中γ-H2AX的相对像元强度。

图6.HOLN-NPs能够保护线粒体并抑制Cyt C/PARP信号通路的激活。A）不同IF处理R28^Glu细胞中cyt C的表达。B）不同处理组R28^Glu中Cyt C的相对像元强度。C）不同IF处理下R28^Glu中parp的表达。D）不同处理组R28^Glu中PARP的相对像元强度。E）使用Tom20抗体通过IF测定线粒体形态。F）分析不同处理组R28^Glu中线粒体的平均长度。G）R28^CON、R28^Glu和HOLN-NPs处理的线粒体的扫描电子显微镜（SEM）图像。

图7.HOLN-NPs在体内能够协同抑制RGC凋亡。A）在构建mice^NMDA模型两天后，通过玻璃体腔注射HOLN-NPs。在模型构建后的第14天，将小鼠处死并取出视网膜进行IF、H&E和WB分析。B）用Nico、OA、N+O和HOLN-NPs处理的mice^NMDA视网膜的H&E染色。。C）通过H&E染色半定量分析不同处理后活mice^NMDA RGC的数量。D）用TUJ-1标记的mice^NMDA视网膜扁平化标本，用Nico、OA、N+O和HOLN-NPs处理。E）小鼠视网膜扁平化标本中TUJ-1阳性RGC的数量。F）共聚焦图像显示用Nico、OA、N+O和HOLN-NPs处理12小时后，TUJ-1标记的RGC中p-CaMKII的表达。G）mice^NMDA、Nico、OA、N+O和HOLN-NPs组中p-CaMKII⁺/Tuj1⁺ RGC的数量。H）通过WB测定不同处理组视网膜中γ-H2A、Cyt C、CaMKII和p-CaMKII的表达水平。I）用TUNEL（红色）染色的视网膜石蜡切片观察细胞凋亡。

图8.HOLN-NPs能够保护RGC轴突免受损伤。A）在构建mice^NMDA模型两天后，通过玻璃体腔注射HOLN-NPs。在模型构建后的第三天，将CTB（Alexa Fluor 555）注入玻璃体腔。在模型构建后的第14天，将小鼠处死并取出视网膜和视神经。通过荧光显微镜观察视网膜和视神经的红色荧光强度，并计算视神经的神经纤维数量。B）mice^NMDA、Nico、OA、N+O和HOLN-NPs眼的RGC轴突的顺行CTB示踪的荧光图像。C）视神经中CTB强度的定量。D）视神经中CTB阳性纤维的定量。E）显示视网膜中CTB填充的全视网膜荧光图像。F）全视网膜中CTB强度的定量。G）通过TB染色评估HOLN-NPs干预对视神经损伤的保护。H）视神经中纤维数量的定量。

图8.HOLN-NPs在体内对小鼠视觉功能和视网膜代谢的影响。A）在构建mice^NMDA模型前两天，通过玻璃体腔注射HOLN-NPs。在模型构建后的第14天，测试小鼠的视觉功能。对每组小鼠的视网膜进行代谢组学分析。B）不同处理后小鼠的FVEP结果。C）小鼠F-VEP振幅的定量。D）小鼠N1和P1波振幅的定量。E）视觉悬崖测试的示意图。F）从mice^NMDA、Nico、OA、N+O和HOLN-NPs处理的小鼠的视觉悬崖表现，数据显示选择浅/深侧的小鼠数量。G）对迫近刺激反应测试的示意图。H）对迫近刺激的反应，从mice^NMDA、Nico、OA、N+O和HOLN-NPs处理的小鼠。数据显示响应者和非响应者的数量。I）火山图显示mice^NMDA和HOLN-NPs组之间视网膜代谢物的差异。J）热图显示通过LC-MS定量的代谢物在mice^NMDA和HOLN-NPs组之间的无监督层次聚类。K）点图描述了mice^NMDA和HOLN-NPs组之间视网膜中前25个KEGG途径。点的大小对应富集比，颜色对应相关的p值。L）mice^NMDA和HOLN-NPs组之间视网膜代谢物的相互作用。

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