四川大学生物医学工程学院吴明雨《Advanced Materials》：通过抑制细菌复活和预防再感染对顽固性生物膜光免疫治疗

摘要

顽固的生物膜感染对公共健康构成严重威胁。临床治疗高度依赖于手术清创和抗生素，这往往会失败，并导致持续和复发性感染。主要的罪魁祸首是持续存在的细菌恢复、定植和恢复活力生物膜，以及继发性病原体暴露，特别是在患有慢性疾病的个体中。解决如何抑制持续的细菌复活和防止再感染仍然是一个主要的挑战。本研究开发了一种低聚乙二醇修饰的亲脂性阳离子光敏剂（PS）TBTCP-PEG7。在光照射下可有效根除耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）。此外，TBTCP-PEG7介导的光动力疗法（PDT）不仅通过下调双组分系统（TCS）、群体感应（QS）和毒性因子来征服顽固的生物膜感染，从而减少细胞间通信，抑制持续的细菌再生和生物膜重构，而且还通过上调热休克蛋白相关基因诱导免疫发生细胞死亡（ICD）来防止再感染，并建立免疫记忆。在体内，TBTCP-PEG7能有效地根除粘附在医疗导管上的MRSA生物膜，刺激血管生成，降低炎症因子的表达，加速伤口愈合。此外，ICD促进短期免疫和长期免疫记忆，以应对继发性感染。这种双管齐下的策略不仅有效地克服了顽固、持续的和反复出现的生物膜感染，而且为下一代抗菌材料的设计提供了理论指导。该研究以题为“Photoimmunologic Therapy of Stubborn Biofilm via

Inhibiting Bacteria Revival and Preventing Reinfection” 发表在Advanced Materials上。    

顽固性生物膜感染是慢性和复发性伤口的主要发病机制，是导致高发病率和高死亡率的重要原因。超过65%的人类微生物感染和80%的慢性感染与顽固的生物膜直接相关。生物膜是由细菌组成的异质结构，将细菌封闭在胞外聚合物（EPS）基质中，可有效降低抗生素的渗透，逃避宿主免疫，使抗生素耐药性增加10-1000倍。生物膜的复发性常导致持续感染，从而导致组织坏死和功能损伤。此外，它削弱了患者的免疫系统，使他们更容易感染其他疾病。目前，机械清创和抗生素仍是临床对抗生物膜感染的主要途径。然而，手术清创的侵入性以及抗生素滥用的耐药性增加和毒副作用往往导致治疗失败和多药耐药性增加。因此，开发新的非抗生素抗菌策略来解决生物膜复发是非常可取的。顽固的生物膜感染有两个罪魁祸首。1)持久性的细菌。在极端条件下，生物膜内的细菌显著降低其代谢，形成持久性细菌以适应营养缺乏和缺氧的微环境。这些细菌能抵抗抗生素和宿主的免疫力。一旦环境压力得到缓解，这些持续的细菌利用信号转导系统，调节药物外排泵，快速恢复生长，重新定居，并恢复生物膜，以增强其耐药性，导致持续和反复的感染。2)继发性病原体暴露。感染或手术伤口愈合缓慢，尤其是糖尿病和癌症等慢性疾病患者以及免疫系统较弱的患者。这些未愈合的伤口在暴露于来自手术器械、医疗器械或环境的细菌时，很容易再次感染，特别是在公共区域，如医院。控制生物膜重建，同时预防再感染是克服复发性生物膜感染的关键。PDT是一种创新的抗菌方法，利用PS产生活性氧（ROS），对细菌造成氧化损伤，具有耐药性强、副作用小、耐药性有限等优点。具有聚集诱导发射（AIE）特性的PSs可以减少非辐射衰减，减少系统间交叉过程中的能隙，从而增加ROS的产生。因此，许多AIE PSs已经被开发出来，以提高EPS的穿透性和克服生物膜感染中的缺氧微环境。最近，我们的小组开发了一系列基于TBTCP的亲脂性阳离子AIE PSs，具有增强的D-Π-A强度策略，表现出优异的ROS生成性能。然而，完全根除生物膜深处的持久性细菌和预防继发感染仍然是一个重大挑战。抗菌免疫疗法可以唤醒或激活身体的免疫系统，以消除致病菌，在控制细菌感染方面很有前途。各种免疫调节方法，如细菌或免疫细胞膜（如巨噬细胞、树突状细胞）修饰疫苗或佐剂可刺激病原体特异性免疫反应。这些方法有可能实现长期的免疫记忆效应，以防止二次暴露。然而，这些治疗方法的有效性和安全性仍需改进。免疫发生细胞死亡（ICD）是一种受调节的细胞死亡，它激活免疫系统以应对各种应激源，包括癌细胞和病原体。ICD促进巨噬细胞的分化和极化，树突状细胞（DC）的成熟，以及效应T细胞和记忆B细胞（mB）的激活，导致短期免疫增强和长期免疫记忆。它为控制继发性感染提供了一个理想的解决方案。虽然PS触发的ICD用于复发性和转移性癌症的光动力免疫治疗是一个日益增长的研究焦点，但ICD在对抗复发性生物膜感染方面很少被报道。此外，目前还没有制定出有效的策略来同时抑制持续的细菌病毒化和防止再感染，从而从根本上战胜反复发生的生物膜感染。

图1. TBTCP-PEG7的分子结构和光物理性质。A)TBTCP-PEG7的分子结构。B)TBTCP-PEG7的摩尔吸收系数和发射光谱。C)TBTCP-PEG7（10μm）在不同PhMe含量的DMSO/PhMe混合物中的PL光谱。D)TBTCP-PEG7（10μm）在水中的尺寸分布及TEM图像。E)不同时间点白光照射下，DCF-DA（10 μm）和10 μm AIE PS下PBS在525 nm处荧光强度（I/I₀）的相对变化。F)在光照下，不存在或不存在TBTCP-PEG7和RB条件下ABDA的分解速率，其中A₀和A为ABDA在378 nm处的吸光度。G)在白光照射下，通过PSs产生·OH的测定。在不同时间点的白光照射下，PBS中有无PSs时，HPF在515 nm处的荧光强度（I/I₀）的相对变化。

图2.TBTCP-PEG7对革兰氏阳性菌的选择性光动力抑菌活性。A)金黄色葡萄球菌，B)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，C)表皮葡萄球菌，D)粪肠杆菌，E)大肠杆菌，F)铜绿假单胞菌，G)Hela细胞，和H) HepG2细胞的存活率。I)扫描电镜图像分析金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在PS培养后的形态变化。J)将Hela细胞与金黄色葡萄球菌或大肠杆菌混合后的荧光图像。

图3.TBTCP-PEG7的抗生物膜活性。A)在培养皿中用结晶紫染色的金黄色葡萄球菌、MRSA和大肠杆菌生物膜的图像。B)残留生物膜生物量的定量分析。C)生物膜中金黄色葡萄球菌、MRSA和大肠杆菌活菌的定量分析。D)经TBTCP-PEG7处理的金黄色葡萄球菌、MRSA和大肠杆菌生物膜的代表性3D图像。E)TBTCP-PEG7在暗或光照射下处理金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生物膜的扫描电镜图像，分析形态变化。

图4.光动力抑制体外生物膜复发。A)体外生物膜复发实验程序示意图。B)生物膜附着导管的体外模型实验程序示意图。TBTCP-PEG7、Van或超声处理前后活细菌生物膜的C) 3D荧光图像，SYTO-9染色。D)TBTCP-PEG7、Van或超声治疗前后导管附着的MRSA生物膜中的菌落平板图像。E)由(C)引起的荧光强度变化的统计图F)(D)导管附着的MRSA生物膜中活细菌计数变化的统计分析。

图5.通过TBTCP-PEG7介导的PDT调控MRSA转录组。A) PCA主成分分析图。B)相关热图：红色表示相关性较高，蓝色表示相关性较低。C)火山图显示显著上调（红色）和下调（蓝色）基因。D)与生物膜形成和信号转导相关的基因的热图。E)与离子调节和氧化应激相关的基因的热图。F)与QS和毒力相关的基因的热图。G)与TCS相关的基因的热图。H)DEGs的氧化石墨烯分析主要集中于生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）。I)对照基因和TBTCP-PEG7+L比较上调基因的KEGG富集气泡图分析。J)对照基因和TBTCP-PEG7+L比较下调基因的KEGG富集气泡图分析。

图6. 体内光动力抗生物膜活性。从植入物中进行生物膜去除的体内实验的A)方案说明。B)不同治疗条件下植入导管感染MRSA生物膜的照片。C)不同治疗方案后植入导管的菌落平板图像。D)导管植入部位感染MRSA生物膜后的伤口愈合照片。E)从不同处理后的伤口组织中代表菌落的平板图像。F)(C)菌落的定量分析G)(E)中菌落的定量分析。H)监测不同实验组小鼠的体重变化。

图7.组织病理分析，评价体内光动力抗生物膜。A)病理分析示意图。小鼠组织的B) H&E染色图像。C)不同治疗组的α-SMA和CD31的免疫荧光染色图像。比例尺：100μm和50 μm。D)CD31免疫荧光强度的定量分析。E)α-SMA免疫荧光强度的定量分析。

图8.在小鼠模型中对MRSA感染的光动力学治疗。A)治疗MRSA感染小鼠模型的程序示意图。B)不同治疗后小鼠的伤口愈合图像。C)不同实验组小鼠创面面积的变化。D)不同处理的小鼠在第3天和第7天的感染组织的平板图像。E)从(D)中获得的菌落数F)不同实验组小鼠的体重变化。G)第11天对组织进行H&E染色。H)第11天，在感染区域的皮下组织中进行IL-6的免疫组化（IHC）染色。

图9.巨噬细胞表型的免疫荧光染色图像。A)免疫荧光分析的方案说明。对F4/80/iNOS进行免疫荧光染色，分别在第3天B)和第7天D)鉴定M1样巨噬细胞。F4/80/CD206的免疫荧光染色，在第3天C)和第7天E)鉴定M2样巨噬细胞。采用免疫荧光法对不同巨噬细胞亚型的细胞进行定量分析, 第3天F,G), 第7天H,I)。

图10.对原发性感染小鼠模型中的免疫因子和细胞的评价。A)免疫分析示意图。B) FCM检测CD80+/CD86+ DCs。C)对树突状细胞的FCM检测方法的定量分析。D)第3天，FCM检测CD8+/CD4+ T细胞。E)CD4+T细胞FCM检测的定量分析。F)CD8-+-T细胞FCM检测方法的定量分析。G) FCM检测CD19+/CD38+ mB细胞。H)对mB细胞的FCM检测方法的定量分析。I) IHC分析第3天脾脏中IL-17的水平。第3天采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清J) IL-17、K) IL-6和L)TNF-α水平。

图11.抑制体内生物膜的复发。A)在继发性感染小鼠模型中抑制生物膜复发的示意图。用1.0×10⁷ CFU mL⁻¹MRSA再感染小鼠。B)第二次暴露于MRSA后脓肿区域发生变化的照片。C)第二次MRSA后第29天记录感染区域的图像。D)不同组小鼠体重变化。E)定量IHC分析和F)第39天脓肿区域的IL-6染色。G)第39天脓肿区的H&E染色。

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