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通过酶催化同时诱导铁死亡和细胞凋亡是一种很有前途的癌症治疗方法。受DNA和−quadruplex/heminDNAzyme结构的启发，通过苯硼酸修饰的透明质酸（HA-PBA）、鸟苷(G)、葡萄糖氧化酶（HA-GOx）作为铁死亡细胞凋亡诱导剂。HPG@ hemin-Gox表现出GOx、类过氧化物酶（POD、类过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）样活性。纳米反应器的GOx活性可以通过在氧气存在下氧化葡萄糖来增加细胞内的过氧化氢（H2O2）的水平。HPG@hemin-GOx的类POD酶活性可以利用生成的H2O2诱导生成羟基自由基。同时，通过类CAT酶活性产生氧气促进GOx的耗氧葡萄糖氧化过程，从而促进细胞内活性氧（ROS）的生成。此外，HPG@hemin-GOx的GPX-样活性可以耗尽细胞内谷胱甘肽，从而下调GPX4的表达。因此，HPG@hemin-GOx通过ROS介导的核DNA和线粒体损伤，以及GPX4缺失诱导的脂质过氧化积累，诱导细胞凋亡和铁死亡，从而在体内外均有很强的抗癌作用。这项工作为构建具有多酶活性的聚合物纳米反应器对−细胞凋亡的协同抗癌治疗提供了一种方法。该研究以题为 “DNA-Free Guanosine-Based Polymer Nanoreactors with Multienzyme Activities for Ferroptosis−Apoptosis Combined Antitumor Therapy”发表在ACS NANO上（DOI:10.1021/acsnano.4c11275）。
传统的癌症治疗策略严重依赖于诱导肿瘤细胞凋亡来达到治疗效果。然而，肿瘤细胞可能逐渐对凋亡产生耐药性，导致治疗结果不理想。因此，迫切需要将非凋亡细胞死亡形式引入肿瘤治疗。铁死亡是一种新发现的不同于细胞凋亡的调节性细胞死亡形式，其特征是活性氧（ROS）和脂质过氧化（LPO）的铁相关性积累。最近的证据表明，同时诱导细胞凋亡和铁死亡可以提高肿瘤治疗的疗效。提高细胞内ROS水平是同时诱导细胞凋亡和铁死亡的有效策略。一方面，过量的ROS会损伤DNA、蛋白质和线粒体，从而诱导细胞凋亡；另一方面，ROS可以增强肿瘤细胞的LPO，导致铁死亡。然而，谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）可以通过介导谷胱甘肽（GSH）依赖的脂质氢过氧化物的消除来抑制铁死亡。因此，理想的铁死亡−凋亡诱导剂不仅能够增加ROS水平，而且有可能耗尽细胞内GSH使GPX4失活。
各种纳米酶已被证明是有效的同时生成ROS和消耗GSH在肿瘤细胞通过模拟自然酶的生物活性，如过氧化物酶（POD），氧化酶（OXD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX），因此被用于实现组合铁死亡−细胞凋亡的抗癌治疗。然而，大多数纳米酶是由无机材料构建的，其生物相容性仍然是一个主要的挑战。DNAzyme是一种由DNA链和血红素分子组成的特殊纳米酶，比传统的无机纳米酶具有更高的生物安全性。DNA四联体是通过氢键相互作用折叠鸟苷DNA序列形成的二级结构。Hemin是一种具有类POD和类GPX活性的小分子。当hemin通过π−π堆叠作用与DNA-四联体结合时，形成的G四联体/血红蛋白复合物可以表现出类POD样和类CAT样活性。因此，G-四重体/血红蛋白DNAzyme可能是一种很有前途的铁死亡/凋亡诱导剂。然而，DNA材料的高成本及其对脱氧核糖核酸酶的敏感性阻碍了它们的进一步应用。
鸟苷是构成RNA的四种主要核苷之一，由一个鸟嘌呤碱基和一个核糖分子组成。与鸟嘌呤诱导的四联体中G-四方体的形成类似，鸟苷中的鸟嘌呤也能使4个鸟苷分子通过Hoogsteen氢键作用组装成鸟苷四聚体平面（(nucleoside-G4）。核苷-G4/血红素复合物在与血红素结合后，也具有酶活性，如类POD酶活性。与DNA材料相比，鸟苷的成本较低；然而，其较差的水溶性限制了鸟苷基核苷-G4/hemin的广泛使用。DNA的磷酸主链由磷酸基和糖单位交替形成，对提高G-四联体的水溶性和稳定性至关重要。受此启发，团队提出将鸟苷偶联到水溶性聚合物透明质酸（HA）上，并使用HA-鸟苷偶联物制备一个稳定的水溶性纳米反应器，其中包含鸟苷基核苷-G4/hemin复合物。目前还没有无DNA鸟苷基聚合物纳米反应器用于−凋亡联合癌症治疗。
在此，陈学思院士团队通过3-氨基苯硼酸（3-APBA）修饰HA（HA-PBA）、鸟苷、血红素和GOx一步组装，制备了HPG@GPX-GOx，同时诱导肿瘤凋亡和铁死亡（示意图1）。考虑到肿瘤细胞内源性过氧化氢有限，将GOx引入HPG@ hemin-GOx，通过在氧（O2）存在下氧化葡萄糖来提高细胞内过氧化氢水平。此外，HPG@hemin-GOx的PODlike活性以所产生的过氧化氢为底物，诱导了羟基自由基（•OH）的产生。同时，纳米反应器的类CAT样活性促进了O2的生成，从而促进了GOx的生成介导过氧化氢的生成和POD样活性催化•OH的产生。由此产生的大量ROS破坏细胞内DNA和线粒体，从而引发肿瘤细胞凋亡。此外，GPX-like活性可使细胞内GSH缺失，从而下调GPX4的表达，增加LPO的积累，促进肿瘤细胞铁死亡。最后，HPG@hemin-GOx通过诱导细胞凋亡和铁死亡，在4T1小鼠乳腺癌模型中可有效抑制肿瘤生长。
示意图1. 具有多酶活性的HPG@hemin-GOx的制备及其作为凋亡−铁死亡诱导剂在肿瘤治疗中的应用
图1. HPG@hemin-GOx的制备和表征。(A) HPG@hemin-GOx的制备示意图。(B) DLS测量的HPG@hemin-GOx。(C) TEM图像的HPG@hemin-GOx。(D) FTIR光谱。(E)Hemin、HPG@hemin、HPG@GOx和HPG@hemin-GOx的紫外−可见吸收光谱。(F)Hemin、HPG@hemin、HPG@GOx和HPG@ hemin-GOx的荧光光谱。(G)GOx-Cy5、HPG@hemin，HPG@GOx-Cy5和HPG@hemin-
GOxCy5的荧光光谱。
图2. HPG@hemin-GOx的多酶活性评价。(A) HPG@hemin-GOx的多酶活性示意图。(B) 在Ti（SO4）2检测的2gL−1葡萄糖存在下，PBS、GOx、HPG@hemin、HPG@GOx和HPG@hemin-GOx的时间依赖性过氧化氢生成。用Ti（SO4）2检测不同浓度的HPG@hemin-GOx与2gL−1葡萄糖孵育后过氧化氢生成的(C)紫外−可见吸收光谱。用PBS、hemin、HPG@hemin、HPG@GOx和HPG@hemin-GOx在2 mM过氧化氢存在下处理的ABTS的(D)紫外−可见吸收光谱。(E)PBS、hemin、HPG@hemin、HPG@GOx和HPG@hemin-GOx在2 mM过氧化氢存在下处理TMB的紫外−可见吸收光谱。(F)PBS、hemin、HPG@hemin、HPG@GOx和HPG@hemin-GOx处理2 mM过氧化氢存在下TMB的吸光度变化随时间依赖性。(G)PBS、hemin、HPG@hemin、HPG@GOx和HPG@hemin-GOx在2gL−1葡萄糖存在下处理ABTS的紫外−可见吸收光谱。(H)PBS、hemin、HPG@hemin、HPG@GOx和HPG@hemin-GOx在2gL−1葡萄糖存在下处理TMB的紫外−可见吸收光谱。(I)使用DMPO作为自旋陷阱，表征hemin、HPG@hemin、HPG@GOx和HPG@hemin-GOx与2gL−1葡萄糖孵育后OH产生的ESR光谱。(J)与PBS、hemin、HPG@hemin、HPG@GOx或HPG@hemin-GOx共孵育后，过氧化氢溶液中的溶解氧含量。(K)DTNB检测的PBS、hemin、HPG@hemin、HPG@GOx和HPG@在1 mM GSH存在下去除GSH的紫外−可见吸收光谱。(L)RhoNox-1的荧光光谱测定了不同浓度GSH下HPG@hemin-GOx孵育后Fe2+的产生。(M)用DTNB检测不同浓度
的HPG@hemin-GOx对GSH的消耗。
图3. GNR@CeO2@GNPs的光热性能。a)单个GNR和杂化GNR@CeO2@GNPs的光生激子重组过程的机制示意图。b)GNRs、GNR@CeO2和GNR@CeO2@GNPs的温度升高曲线。c)不同808 nm激光功率密度下的温度升高曲线。d)GNR@CeO2@GNPs悬浮液的温度升高与激光功率密度之间的线性关系。e)在1.0Wcm−2的808 nm照射下，GNR@CeO2@GNPs的浓度依赖性光热效应。f)通过打开和关闭NIR激光器，GNR@CeO2@GNPs溶液中的温度变化。g)进行连续5次激光开/关循环的热稳定性测量。
图4. HPG@hemin-GOx的细胞毒性机制。(A)4T1细胞共聚焦显微镜观察和γ-H2AX免疫荧光染色。与(B)对应的γ-H2AX的平均荧光强度（MFI）统计。(C)共聚焦显微镜观察不同处理和JC-1染色后的4T1细胞。JC-1聚集体（红色）和JC-1单体（绿色）与对统计数据(D)。(E)采用流式细胞术和Annexin V-FITC/PI法分析不同纳米颗粒处理后的4T1细胞的凋亡情况。Q1：坏死，Q2：晚期凋亡，Q3：早期凋亡，Q4：正常。(F)凋亡统计。(G) Western blot分析不同组GPX4的表达。(H)4T1细胞经不同处理和C11-BODIPY 581/591染色后的荧光显微镜观察。(I)不同处理后4T1细胞的MDA水平。(J)Fer-1对不同配方的细胞毒性的抑制作用。(K)描述HPG@ hemin-GOx治疗引起的细胞凋亡和铁死亡的方案。
图5. 体内抗肿瘤疗效评价。(A)静脉注射cy5标记的HPG@hemin-GOx24小时后，切除的主要器官和肿瘤的代表性荧光图像。(B)定量荧光强度统计。(C)对荷瘤小鼠的治疗程序示意图。(D)不同组肿瘤的平均生长谱。(E)治疗14天后解剖肿瘤组织的数码照片。(F)不同治疗后的平均肿瘤重量。(G)不同处理后肿瘤组织的H&E、TUNEL、绿色)、Ki67（红色）、GPX4（黄色）、C11-BODIPY 581/591（红色未氧化，绿色氧化）染色图像。(H)对 TUNEL、(I) Ki67、(J) GPX4和(K) C11-BODIPY染色结果的统计学分析。
综上所述，本研究通过HA-PBA、鸟苷、Hemin和GOx的一步组装，构建了无DNA的鸟苷基聚合物纳米反应器HPG@hemin-GOx。HPG@hemin-GOx多酶活性的协同作用显著提高了细胞内ROS水平，导致核DNA和线粒体损伤，从而导致肿瘤细胞凋亡。此外，HPG@hemin-GOx的GPX样活性可导致细胞内GSH的消耗，从而下调GPX4的表达，增强细胞内LPO的积累，最终促进肿瘤细胞的铁死亡。最后，HPG@hemin-GOx通过同时诱导细胞凋亡和铁死亡表现出有效的抗癌作用，这在体内外均得到了证实。总之，这工作为铁死亡−凋亡诱导剂的制备提供了一种有效的途径，并有可能促进肿瘤催化治疗的发展。
论文链接（DOI）：
https://doi.org/10.1021/acsnano.4c11275
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