中国科学院深圳先进院赖毓霄教授《BAM》：3D打印二氧化锰支架通过重塑骨再生微环境促进难治性骨缺损的成骨-血管生成耦合

摘要

对于难治性骨缺损的治疗对临床医生来说是一个棘手的挑战，特别是类固醇相关性骨坏死（SAON），其特征是成骨和血管生成不足。本文介绍了一种由聚L -丙交酯（PLLA）和二氧化锰（MnO₂）纳米颗粒组成的微环境响应性支架，旨在通过清除内源性活性氧（ROS）和原位调节免疫微环境来促进骨再生。MnO₂与内源性过氧化氢（H₂O₂）在酸性和富含活性氧骨缺损区域，发生过氧化氢酶样催化反应，触发O₂和Mn²⁺的按需释放，同时通过促进巨噬细胞的M2型极化，重新调节有利于血管生成和成骨的骨免疫微环境，显著改善炎症反应。此外，作者团队通过转录组测序分析探索其基本机制，发现PLLA/MnO2支架（PMns）通过上调人骨髓间充质干细胞（hBMSCs） TGF-β/Smad信号通路促进成骨分化。总的来说，PMns具有优越的免疫调节，优异的成骨血管生成特性，有望成为治疗临床难治性骨缺损的骨移植的替代品。该研究以题为“3D-printed manganese dioxide incorporated scaffold promotesosteogenic-angiogenic coupling for refractory bone defect by remodeling osteo-regenerative microenvironment” 发表在Bioactive Materials上。  

类固醇相关性骨坏死（SAON）是一种具有挑战性的骨科疾病，在长期和/或高剂量皮质类固醇治疗感染性疾病（如2019冠状病毒病[COVID-19]、严重急性呼吸系统综合征[SARS]）和类风湿疾病（如强直性脊柱炎[AS]、类风湿关节炎）后出现。近年来，SAON的发病率逐年上升，已成为非外伤性骨坏死的主要原因。在SAON早期，核心减压（CD）手术可以通过去除坏死骨组织和降低骨内压力来减缓骨坏死的进展。CD手术引起的骨缺损被认为是一种难治性骨缺损，需要大量填充以增强手术部位的机械强度，防止骨塌陷。难治性骨缺损通常指由于骨缺损的严重程度，大小及位置而难以用常规方法愈合或诊治的骨缺损。这些缺损可由多种原因引起，包括创伤、肿瘤切除、感染或骨质疏松、骨坏死等疾病，通常需要专门的治疗策略，如自体或异体骨移植、生物材料支架或先进的再生医学技术来促进骨再生和愈合。自体骨移植被认为是CD手术后的治疗的金标准。然而，它的应用受到供体稀缺、继发性损伤和免疫排斥等问题的限制。为了克服这些局限性，3D打印支架凭借其独特的个性化定制能力和高精度而受到研究人员的广泛关注。这些支架具有促进骨再生的几个优点，包括优异的机械强度、适度的生物降解性、优异的骨导电性和骨诱导性。尽管拥有着这些优势，但与病理生理微环境相关的挑战继续阻碍骨再生。在SAON中，由于脂质代谢异常、血供不足、血管内凝血和成骨细胞凋亡，导致骨再生过程延迟，主要原因是类固醇给药前过敏性血管炎引起的血管损伤导致骨内缺血。随着对骨再生的深入了解，越来越清楚的是，坏死区血管生成和成骨结合是治疗SAON相关骨缺损最有希望的方法。

坏死缺损区以骨内血管受损导致的缺氧为特征，这损害了细胞活力和增殖，导致高浓度的活性氧（ROS），包括羟基自由基（•OH）、超氧阴离子（O2⁻）和H₂O₂组成。过量的ROS可诱导成骨前体细胞和成熟成骨细胞凋亡，同时促进破骨细胞祖细胞的增殖和活性。此外，破骨细胞和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的产生进一步升高ROS水平，延长缺损部位的炎症期和血管病变。因此，骨再生陷入了一个恶性循环，其特征是不利于新骨形成的微环境和骨免疫稳态失调。

顽固性骨缺损引发复杂的免疫反应，其中异常或延长的免疫反应阻碍骨再生，主要是由于免疫调节不足。骨缺损后，巨噬细胞被募集并极化为M1表型，分泌促炎因子如肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素-6 （IL-6）、单核细胞趋化蛋白-1 （MCP-1）和白细胞介素-1β (IL-1β)。这些细胞因子引发邻近骨组织的损伤。或者，巨噬细胞可以极化为M2表型，分泌白细胞介素-4 （IL-4）、白细胞介素-10 （IL-10）和转化生长因子-β (TGF-β)等抗炎因子，减轻炎症反应，促进骨生成和血管生成。因此，调节M1/M2表型转化抑制骨缺损区炎症反应是促进骨再生的有效策略。

MnO₂可以有效调节SAON的病理微环境，在SAON骨修复中具有“三合一”的功能。(1) MnO₂具有清除ROS的能力，能有效地将H₂O₂分解为氧气（O₂）和H₂O，缓解缺氧微环境，保护抗氧化酶系统，防止氧化应激损伤细胞。（ii）二氧化锰降解释放的锰离子（Mn²⁺）作为免疫刺激物，参与多种生理过程，包括免疫反应。（iii）据报道，Mn²⁺可以增强各种含锰生物材料中成骨细胞的粘附和活力，并增加成骨相关基因的表达。此外，Mn²⁺抑制骨质疏松大鼠的破骨细胞功能和形成。既往研究表明，MnO₂基生物材料可促进骨组织修复，但对于MnO₂是否调节骨免疫微环境促进SAON骨缺损成骨-血管生成耦合的研究有限。因此，在SAON骨缺损中使用MnO₂可能有助于降低ROS水平，供应O₂，调节骨免疫微环境，促进骨生成和血管生成，从而有助于临床难治性骨缺损的修复。

骨移植替代物用于CD术后治疗SAON骨缺损区域的填充，需要具有良好的生物活性和适当的机械强度。PLLA是一种很有前途的可生物降解聚合物，抗压强度与天然松质骨相当，已被批准用于临床应用。然而，PLLA仅具有骨导电性，缺乏骨诱导性能，因此需要对支架进行修饰。低温快速成型（LT-RP）3D打印技术通过喷射或挤压到低温环境中，逐点精确控制溶液基材料的沉积。这个过程允许快速冻结和凝固，伴随着相分离形成微孔。随后的冷冻干燥使溶剂蒸发和支架凝固。与其他打印技术相比，打印过程不需要引入可能会降低植入物的生物活性和生物相容性的反应引发剂和高温。

研究概况

在这项工作中，作者团队通过低温沉积 3D打印技术将聚L -丙交酯（PLLA）与二氧化锰（MnO2）纳米颗粒结合制成了微环境响应支架PMns，其通过调节巨噬细胞极化，显著清除ROS，抑制炎症反应。同时作者团队将PMns植入SAON大鼠股骨髁缺损，研究了其对骨生成、血管生成和骨免疫调节的影响。该研究证明PMns具有良好的成骨-血管生成耦合作用和骨免疫调节功能，有利于治疗难治性骨缺损。

图1.MnO₂掺入3D打印支架示意图，通过平衡氧化应激和增强成骨-血管生成耦合，有效促进难治性骨缺损愈合。A)使用LT-RP 3D打印技术制造PMns的过程。B)3D打印支架的临床应用场景。在股骨头SAON早期，将PMns植入CD后缺损部位，通过多步协调，清除过多的ROS，调节巨噬细胞极化，促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化，有效促进骨坏死部位的新生血管和骨再生。

图2.PMns的制备与表征。(A) PMns制备过程示意图。（B - D） P10Mn支架的显微CT结构观察：三维重建(B)，横切面(C)，三维图像显示相互连接的孔隙(D)。（E-G） SEM图像详细描述了P10Mn支架的形态。30 × (E)、1000 × (F)、3000 × (G)的横截面。（H - K） P10Mn支架横截面SEM-EDS分析显示碳（C，黄色）(H)、氧（O，红色）(I)和锰（Mn，绿色）(J)的元素映射，完整的EDS元素谱如图(K)所示。（L和M）不同支架的抗压强度和抗压模量。（N - P） PMns的降解特性：不同支架在PBS中降解时的(N)pH值、(O)失重，(P)释放的Mn离子浓度(Q)不同H₂O₂浓度下P10Mn支架的产氧曲线。

图3.PMns保护细胞免受氧化损伤和清除细胞内ROS。(A)细胞实验设计示意图。(B) 100 μM H₂O₂作用24小时后hBMSCs的活（绿色）/死（红色）染色。(C)死活比定量分析。(D) 100 μM H₂O₂ 作用24小时后hBMSCs的细胞内ROS染色。(E) hBMSCs的ROS荧光强度定量分析。(F)不同处理下共培养hBMSCs在100 μm H₂O₂下的凋亡流式。(G) HUVECs在100 μM H₂O₂作用24小时后的活（绿）/死（红）染色。(H) PMns和H₂O₂处理HUVECs 24小时后ROS的荧光图像。(I) PMns和H₂O₂培养24小时HUVECs伤口愈合实验图像。（J-L） HUVECs的死活比、ROS荧光强度、迁移距离定量分析。(M) H₂O₂处理和不同支架培养的HUVECs中抗氧化基因的表达。(N) PMns通过增强抗氧化性能，降低ROS水平，促进细胞增殖和迁移。

图4.PMns促进hBMSCs成骨分化和转录组学分析。(A)成骨诱导7天后的ALP染色。(B)不同处理共培养7天hBMSCs的ALP活性。(C)成骨诱导14天后ARS染色钙沉积。(D) ARS染色定量分析。（E-H）不同处理7天和14天hBMSCs中Runx2、OPN、OCN和CoL-1基因表达的qRT-PCR分析。（I-K）成骨分化的转录组学分析。(I)火山图显示P10Mn与对照组基因表达差异（红色表示高表达，蓝色表示低表达）。(J)成骨相关基因热图。(K) KEGG途径富集分析气泡图。(L) TGF-βRI、TGF-βRII、p-Smad2/3、Smad4、Runx2、Osterix蛋白的Western blotting。(M) PMns通过TGF-β-Smad信号通路促进成骨分化的潜在机制示意图。

图5.巨噬细胞极化对体外血管生成的影响。(A)与不同支架共培养并LPS刺激24小时的RAW 264.7细胞中M1标记物iNOS的表达。(B) iNOS荧光强度定量分析。(C) M2标记物CD163在RAW 264.7细胞中的表达。(D) CD163荧光强度定量分析。（E-G）不同处理24h RAW 264.7细胞促炎基因的表达水平。（H-J）不同处理24h RAW 264.7细胞抗炎基因表达水平。（K-N） ELISA分析IL-1β、TNF-α、VEGF、TGF-β。(O)不同支架处理条件培养基对HUVECs的transwell、创面愈合和管状形成的影响示意图。(P) HUVECs迁移与条件培养基共培养的代表性图像。(Q) HUVECs划痕实验图像。(R)与条件培养基共培养6小时后成管的荧光图像。(S) transwell实验中HUVECs迁移数量的量化。(T)划痕实验中HUVECs的迁移距离。(U)血管形成网格数量的量化。

图6.SAON大鼠股骨骨缺损区血管生成和骨生成的评价。(A)动物实验时间表示意图。(B)具有代表性的骨孔道DCE-MRI时间信号曲线，显示各组各时间点信号强度在20分钟内的连续变化。(C)术后不同时间点SAON大鼠股骨远端显微ct血管造影三维重建图像。白色矩形代表骨孔道部位。（D，E）灌注参数定量分析：各组术后不同时间点最大增强率和冲洗率。动态对比增强；SI =信号强度；ME = Max Enhancement （n = 3）。(F)术后不同时间点SAON大鼠股骨缺损区感兴趣区（ROI）的代表性显微CT三维图像。(G)各组术后各时间点骨小梁厚度分布分析。（H-K）术后不同时间点新生骨小梁显微CT参数定量评价：骨密度（BMD）；骨体积比（BV/TV）；小梁数（Tb.N）；小梁分离（Tb.Sp）

图7.PMns对SAON大鼠股骨缺损体内免疫调节作用的评价。(A) iNOS标记物免疫荧光染色鉴定各组M1巨噬细胞表型。(B)不同组iNOS荧光强度定量分析。(C) CD163标记物免疫荧光染色鉴定各组M2巨噬细胞表型。(D)不同组CD163荧光强度的定量分析。（E-H） ELISA法测定SAON大鼠血清中炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）和抗炎因子（IL-10）的含量。

图8.骨缺损区新生骨和血管形成的组织学评价。(A)不同组骨缺损区域的戈德纳三色染色。黑色方块表示新骨形成部位，在图中用200倍放大镜放大。(B)未钙化切片的序列荧光显微照片显示新骨生长，Calcein-AM荧光为绿色，二甲醇橙荧光为红色。黄色双箭头表示新生骨组织之间的距离。（C， D）术后不同时间点MAR和BFR的骨组织形态学。(E) H型血管的CD31（红色）和EMCN（绿色）免疫荧光染色。较低的面板显示了左侧面板中白色矩形区域的较高放大倍数。（F， G）基于免疫荧光染色图像的CD31和EMCN定量分析。MAR =矿物堆积率；BFR =骨形成率。

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