铜绿假单胞菌在医院感染中导致高发病率和死亡率，而新批准的抗生素几十年来一直在下降。采用绿色和通用的脱质子驱动策略来筛选鸟苷酸-金属离子配位聚合物纳米颗粒（GMC），而不是在特定的金属离子参与时发生结合失败。我们发现，GMC-2精确的ph依赖的氧化酶样活性协调了对铜绿假单胞菌生物膜感染的双重免疫调节交响乐。具体来说，gmc-2介导的活性氧（ROS）调控触发线粒体功能障碍，释放损伤相关的分子模式，参与模式识别受体，导致内源性先天免疫激活。同时，在轻度酸性的生物膜环境中，GMC-2触发的ROS的产生破坏了生物膜，暴露了外源性病原体相关的分子模式。与传统抗生素相比，GMC-2不能导致对铜绿假单胞菌的耐药性。在感染的植入小鼠模型中，铜绿假单胞菌生物膜被GMC-2介导的先天和适应性免疫触发有效消除。这些发现为促进生物分子与金属离子的结合提供了一种通用的方法，并强调了精确的ROS调节平台在启动靶向细菌生物膜感染的内源性和外源性免疫激活中发挥了关键作用。该研究以题为“Cobalt ions-derived nanoenzyme array for endosseous neural network reconstruction and osseointegration” 发表在Bioactive Materials上。
铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）是最致命的致病生物之一，可导致骨科植入物或囊性纤维化患者的高发病率和死亡率的医院感染。临床上使用的抗铜绿假单胞菌抗生素有限，但由于其外膜渗透性低和有效的外排系统，其耐药性稳步增加，新批准的抗生素几十年来一直在下降。生物膜内的病原体通过使宿主免疫细胞极化为抗炎表型并直接杀死宿主免疫细胞，从而逃避宿主的免疫防御系统。在后抗生素时代，协同抗生物膜和宿主免疫激活等治疗方法作为解决顽固性铜绿假单胞菌生物膜的一种很有前途的策略，已经引起了相当大的关注。先前的研究表明，活性氧（ROS）通过破坏致密的生物膜结构，使病原体被破坏，激活免疫信号通路和炎症信号通路，如核因子kappa-B（NF-κB）。然而，在细菌免疫治疗中，ROS内源性激活宿主免疫的报道很少，其潜在机制尚未完全阐明。细胞应激和氧化损伤，部分来源于细胞内过量的ROS，破坏氧化还原信号，并触发线粒体DNA（mtDNA）释放配位聚合物纳米粒子（CPNs）由核苷酸和金属离子（Mn+）自组装而成，在催化、生物传感和纳米医学等多种领域表现出了应用前景。
一种ph依赖的氧化酶样活性的GMP-Mn2+cpn-2（GMC-2）被开发。具体来说，GMC-2介导的ROS调控触发线粒体功能障碍，释放DAMPs，参与PRRs，导致内源性先天免疫激活。同时，在轻度酸性的生物膜环境中，GMC-2触发的ROS的产生破坏了生物膜，暴露了外源性的pamp。此外，与传统抗生素相比，GMC-2不能引起对铜绿假单胞菌的耐药性。在感染的植入小鼠模型中，可有效消除铜绿假单胞菌的生物膜。
图1.阐明铜绿假单胞菌(铜绿假单胞菌（aeruginosa）生物膜感染的机制。(A)一种创新的、通用的脱质子驱动策略来协调鸟苷酸（GMP），避免了特定金属离子参与时GMPMn+结合的失败，并开发了具有ph依赖氧化酶活性的GMP-Mn2+配位聚合物纳米颗粒-2（GMP-Mn2+CPn2+-2，称为精确的GMC-2）。(B)GMC-2介导的活性氧（ROS）调控触发线粒体功能障碍，释放损伤相关的分子模式（DAMPs），参与模式识别受体（PPRs），并导致内源性先天免疫激活。同时，在轻度酸性的生物膜环境中，gmc-2触发的ROS的产生破坏了生物膜，暴露了外源性病原体相关分子模式（PAMPs）。通过精确的铜绿葡萄糖调节平台触发内源性和外源性免疫反应，铜绿假单胞菌生物膜可有效消除。
图2.ROS调节平台的制备和表征。(A)GMP-Mn+CPNs合成路线示意图。(B)GMP的静电势（ESP）图。(C) 1 H和(D) 31P NMR滴定GMP与氯化锰。(E)GMP-Mn+CPNs上氧还原反应的吉布斯自由能谱。(F)GMP-Mn+沉淀物的状态总结；显示了每个反应的pH值。(G)加入60 μL 1M氢氧化钠溶液（n = 3）的典型无定形GMP-Mn+cpn的类氧化酶活性。最上面的插图是在水溶液中的无定形的GMP-Mn+cpn。中间的插图是由相应的cpn催化的3,3‘，5,5’-四甲基联苯胺（TMB）溶液的光学图像。(H)非定形GMP-Mn+cpn的米凯利斯-门滕曲线。(I)GMC-2检测电流在氧（O2）、空气或氮（N2）作用下的极化曲线。(J)GMC-2精确的ph依赖的类氧化酶活性。
图3.免疫激动剂的筛选及内源性免疫激活的机制。与GMP-Mn+沉淀物孵育的RAW264.7细胞上清液中的(A)干扰素-β（IFN-β）的浓度。不同配方的上清液中(B) IFN-β的浓度（n = 3）。抗坏血酸（AA）清除(C)活性氧（ROS）。不同AA浓度（n = 3）激活RAW264.7细胞。(E)2‘，7’-二氯荧光素（DCF）荧光强度（n = 4），(F) ROS荧光图像，(G) γ-H2AX荧光强度（n = 4），和(H)不同处理后的RAW264.7细胞的相对胞质mtDNA拷贝数（n = 3）。(I)不同配方后RAW264.7细胞上清液中IFN-β（n = 4）和(J)肿瘤坏死因子-α（TNF-α）（n=5）的浓度。(K)主成分分析（PCA）图，(L)KEGG富集分析，(M)基因集合富集分析（GSEA），(N)热图显示RAW264.7细胞在不同配方后差异表达的基因；红色，上调；蓝色，下调；|log2 fold变化|≥1，p < 0.05。(O) Mechanism of endogenous immune activation by GMC-2. ns represents no significance, *p < 0.05, **p <0.01, ***p < 0.001.
图4.外源性病原体相关抗原的释放。(A)GMC-2对浮游铜绿假单胞菌的抗菌活性（n = 4）。(B)不同配方后铜绿假单胞菌的代表性扫描电镜（SEM）图像。(C)GMP、Mn2+和GMC-2对铜绿假单胞菌的抗菌效率（n = 3）。(D)细菌菌落计数的图像。(E)铜绿假单胞菌DCF荧光强度的典型流式细胞术图。(F) 3D共聚焦显微图和(G)铜绿假单胞菌生物膜Syto 9/PI染色的代表性流式细胞术图。(H)铜绿假单胞菌耐药性的评估。(I)最低抑菌浓度（MIC）和(J)对铜绿假单胞菌的抗菌效率（n = 5）。(K)全基因，(L)火山图和(M)铜绿假单胞菌转录组中的耐药基因；红色，上调；绿色下调；|log2倍变化|≥1，p < 0.05。(N)GMC-2从铜绿假单胞菌生物膜中释放外源性病原体相关抗原的机制。 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
图5.增强免疫细胞对抗细菌的免疫力。(A)活/死染色显微镜图像和(B)低温切片和透射电镜（TEM）图像原始264.7孵化后铜绿假单胞菌和治疗24小时(C)铜绿假单胞菌菌落（n = 6），(D) IFN-β（n = 4），(E) TNF-α（n = 4），(F) IL-1β（n = 3）和(G) IL-6（n = 3）浓度的上清液264.7与铜绿假单胞菌孵化24小时后治疗。(H)小鼠骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）和(I)小鼠骨髓源性树突状细胞（BMDCs）处理24小时后的代表性流式细胞术图和定量分析（n = 3）。(J)RAW264.7与绿色绿荧光蛋白标记的铜绿假单胞菌(GFP-P。 A.)处理1h后，用Hoechst和WGA染色。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
图6.在小鼠模型中进行医学植入物感染的治疗。(A)该方案显示了植入铜绿假单胞菌生物膜感染小鼠模型和给药。(B)个体感染区域的生长曲线（n = 6）。(C)给药后手术区域的代表性照片。(D)苏木精和伊红（H&E），(E)细胞角蛋白10/细胞角蛋白14（CK10/CK14）免疫荧光，(F) Giemsa，(G) Masson，(H) CD31免疫荧光和(I) Ki67免疫荧光染色第5天不同治疗后感染周围组织的典型图像。(J)-(M)单个组织学染色的定量分析，菌落为= 10；胶原蛋白、CD31、=1和Ki67。(N)显示肝肾功能和全血细胞计数以评估生物相容性的热图。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
图7.体内免疫学分析。(A)方案显示了免疫学分析的过程。(B)M1表型巨噬细胞（M1 Mφ，CD80+CD206−）通过门控CD11b+F4/80+细胞、CD11c+CD86+)的(C)成熟DCs(CD80+CD86+细胞、(D) T辅助细胞（CD3+CD4+CD8−）和(E)激活自然毒性T细胞（CD49b+细胞）（NK）细胞（CD107a+）。(F)-(I)脾脏相应的图和分析。(J)小鼠血清中IFN-β、TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度（n = 4）。(K)GMC-2催化先天和适应性免疫对抗细菌生物膜感染示意图。以ns、*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001表示，均无显著性差异。
综上所述一种绿色和通用的逐步脱质子驱动策略来协调GMP与过渡金属，而不是在特定金属离子参与时，HEPES缓冲液和去离子水反应体系中GMP-Mn+结合失败。令人印象深刻的是，我们筛选了具有良好类氧化酶活性的非定形GMP-Mn2++（Km=63.565μM，νmax=1.463μM−1），并与其他GMP-Mn+和报道的拟酶复合物进行了比较。GMC-2微妙调控ROS导致线粒体功能障碍，氧化应激诱导mtDNA（DAMPs）释放到细胞质中，从而参与PRRs，导致宿主的内源性先天免疫激活。在轻度酸性的生物膜环境中产生足够的ROS很容易破坏细菌生物膜，暴露外源细菌相关抗原（PAMPs）。与氨苄西林相比，GMC-2不能对铜绿假单胞菌产生耐药性。GMC-2（0.25×MIC）适时使用减轻铜绿假单胞菌介导的巨噬细胞损伤，而不是低浓度的氨苄青霉素，但没有。此外，在植入物感染的小鼠模型中，GMC-2通过触发先天免疫和适应性免疫，有效地消除了铜绿假单胞菌的生物膜，加速了被感染组织的修复。本研究提供了一种绿色和通用的逐步脱质子驱动策略，促进了生物分子与营养金属离子的结合。此外，本研究的结果为抗菌免疫治疗提供了一个具有明确机制的范例，并强调了ROS的精确调控对于启动对铜绿假单胞菌生物膜感染的内源性和外源性免疫应答至关重要。
论文链接（DOI）：
https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2024.10.026
申明：本微信号转发内容仅做学术交流使用，不作为商业用途，也不代表支持或赞同其观点，如涉及知识产权保护问题或其他方面的问题请及时联系小编，我们会尽快协调处理。本微信号原创文章版权归本微信号所有，欢迎分享到朋友圈等非媒体上。
联系小编可免费投稿推送，本公众号另建有纳米医学实名学术交流群，请备注姓名+单位+研究方向添加下方微信号。
往期推荐：上海大学生命科学学院陈雨教授《Chem Soc Rev》：用于治疗应用的微生物-材料混合物
点击“阅读原文”，通往论文原文
「ENDING」
投稿微信｜nanomedicine1
投稿邮箱｜xianwenwang@126.com
关注纳米医学进展
了解纳米医学前沿
长按二维码私信投稿
