骨感染是临床骨科的一大灾难。尽管是骨髓炎的标准疗法，但载抗生素的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）骨水泥对生物膜中的细菌的效力较低。此外，高剂量抗生素负载的植入物存在细菌耐药性、组织毒性和局部组织愈合受损的风险。通过将硼硅酸盐生物活性玻璃（BSG）加入到低剂量硫酸庆大霉素（GS）负载的PMMA骨水泥中，设计了一种协同根除细菌并依次促进骨整合的智能策略。结果表明，BSG不会损害骨水泥的处理性能，但实际上赋予了其离子和碱性微环境，从而破坏细菌细胞壁和细胞膜的完整性，通过破坏细胞膜中的呼吸链和糖原代谢抑制ATP合成，并通过削弱抗氧化剂成分（过氧化物酶体和类胡萝卜素）提高活性氧（ROS）水平。BSG的这些抗菌特性协同增强了GS的有效性，其远低于实际临床剂量，通过与核糖体的30S亚基结合实现了有效的细菌杀灭和生物膜清除。此外，种植体释放的GS和离子、碱性微环境促进了hBMSCs的体外成骨活性，并协同促进了体内骨整合。总之，该研究强调了BSG的掺入为减少抗生素剂量提供了一种有前景的策略，同时增强了种植体的抗菌活性和骨生成。这种方法有可能解决细菌耐药性和骨感染之间的冲突。该研究以题为“Borosilicate bioactive glass synergizing low-dose antibiotic loaded implants to combat bacteria through ATP disruption and oxidative stress to sequentially achieve osseointegrationg” 发表在Bioactive Materials上。
骨髓炎是一种骨科感染性疾病，其特征是骨质溶解和骨破坏，由致病菌引起。它代表了临床骨科的灾难性并发症，通常对发病率和死亡率构成挑战。最近的临床流行病学调查已经确定了金黄色葡萄球菌作为引起骨感染的主要致病菌。由于金黄色葡萄球菌可以逃避感染部位内的免疫系统或抗生素的检测，导致金黄色骨髓炎具有高复发率。以前的报告指出，金黄色葡萄球菌可能导致感染复发，即使在治疗29年后，随之而来的大感染性骨缺损的发展是令人担忧的，并强调了问题的严重性。目前，治疗金黄色骨髓炎涉及局部或全身抗生素和手术干预。不幸的是，全身性抗生素治疗由于药物渗透到受感染的骨髓中有限而面临困难，通常需要延长疗程和增加剂量，这可能导致器官毒性和抗生素耐药性。抗生素骨水泥（ALBC）是一种广泛用于治疗骨骨髓炎伴感染性骨缺损的全身性方法，前提是高剂量局部给药对于根除生物膜相关细菌至关重要。载抗生素的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）骨水泥是临床治疗骨感染最常用的药物载体。
硫酸庆大霉素（GS）因其广谱、高效和稳定性而成为广泛用于治疗骨感染的一线抗生素。然而，尽管其在PMMA中的浓度较高，但载GS PMMA骨水泥治疗骨感染的治愈率有时会低得令人失望。为了最大限度地降低聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥中GS的含量，同时仍具有高效的抗菌和成骨活性，该研究将BSG加入到抗菌聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥中，以创建一种生物活性抗菌聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥。将固相（BSG、PMMA、GS和ZrO 2）与液相[甲基丙烯酸甲酯（MMA）和N，N-二甲基对甲苯胺（DMPT）]充分混合，以制备具有生物活性的抗菌PMMA骨水泥。BSG的降解微环境与GS在PMMA骨水泥中的释放相互促进，在体内外产生协同抗菌活性。这种破坏允许更多的释放离子和GS（抑制核糖体的30 S亚基）在细胞内抑制ATP合成的过程，并削弱抗氧化成分（过氧化物酶体和类胡萝卜素），触发氧化应激反应。该复合微环境具有良好的生物相容性和生物安全性，可协同促进hBMSCs体外增殖和成骨分化，促进体内骨整合。总之，在低剂量抗生素背景下，BSG的掺入成为消除生物膜并随后促进新骨生长的有效且可行的策略。这种方法为临床环境中抗生素耐药性和骨感染带来的挑战提供了一种潜在的解决方案。
图1生物活性抗菌PMMA骨水泥的制备、应用和抗菌机理示意图。
图2.生物活性抗菌聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥的制备与表征。(a)BSG颗粒的扫描电子显微镜（SEM）图像（白色标尺= 5μm;黑色标尺= 2μm）。(b)B/G/PMMA骨水泥形态的横截面（白色比例尺= 50μm;黑色比例尺= 20μm）和（c）B/G/PMMA骨水泥的元素能量色散X射线光谱（EDS）图（比例尺= 100μm）。(d)水泥的加工次数。(e)预固化水泥的抗压强度和（f）四点弯曲强度。骨水泥浸泡在PBS中后的抗压强度（g）和四点弯曲强度（h）变化。(i)pH值，（j）BO33-的累积释放，（k）Ca2+的累积释放，（l）PBS中骨水泥的硫酸庆大霉素（GS）的累积释误差线代表标准差（n = 3）。
图3.生物活性抗菌PMMA骨水泥对金黄色葡萄球菌的体外抗菌能力评价。(a)利用光学显微镜观察了金黄色葡萄球菌和（B）菌落形成的定量分析。(c)对金黄色葡萄球菌在使用Alamar Blue试剂（激发波长：560 nm;发射波长：590 nm）的水泥样品表面上培养6小时后的结果。(d)活/死染色（比例尺= 75μm）和（e）形态学（比例尺= 2μm）。金黄色葡萄球菌在骨水泥样品表面培养6小时后。数据表示为平均值±SD。误差线表示标准差（n = 6）
图4.金黄色葡萄球菌与骨水泥培养后的转录分析。火山图显示了PMMA和B/PMMA组(A)以及B/PMMA和B/G/PMMA组(B)之间的基因表达差异。(C)差异表达基因的维恩图。(D)用基因集浓缩分析(GSEA)分析PMMA和B/PMMA组之间金黄色葡萄球菌的跨膜转运、离子转运、膜组成部分和跨膜转运蛋白活性。(E)利用京都基因和基因组百科全书(KEGG)分析比较PMMA组和B/PMMA组之间金黄色葡萄球菌上调基因和下调基因。(G)用KEGG分析比较B/PMMA和B/G/PMMA组之间金黄色葡萄球菌基因的上调和下调。(i-k)蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络m所示的生物过程之间的联系。
图5. 生物活性抗菌聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥的抗菌机理。(a)组间通路变化。通过蛋白质浓度检测（B）和邻硝基苯β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）试验（c）检查细菌膜渗透性。(d)生物膜的结晶紫染色和（e）其在562 nm的定量分析。(f)在595 nm处进行ATP定量分析。(g)用2，7-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）检测活性氧（ROS）水平及其定量分析，激发波长：480 nm，发射波长：525 nm，刻度尺= 50μm。数据表示为平均值±SD。误差线表示标准差。采用Tukey事后检验和Student t检验，通过单因素ANOVA计算P值。n = 3
图6.骨水泥对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。(a)共培养1天、3天和5天后hBMSC的细胞毒性和增殖。(b)共培养24 h后hBMSC的活/死（比例尺= 200μm）和细胞骨架染色（比例尺= 50μm）。(c)共培养模式示意图。(d)hBMSC的碱性磷酸酶（ALP）染色，比例尺= 50μm。(e)培养7天后细胞培养基中ALP的定量分析。(f)共培养14天后hBMSC的茜素红S（ARS）染色，比例尺= 50μm。(g)hBMSCs ARS染色定量分析。(h)碱性磷酸酶（ALP）和（i）共培养7天后hBMSC的runt相关转录因子2（RUNX2）基因表达。(j)共培养14天后hBMSCs的骨钙素（OCN）和（k）骨桥蛋白（OPN）基因表达。(l)共培养7d和14d后hBMSCs的RUNX2和OCN蛋白分泌量。数据表示为平均值±SD。误差线表示标准差。采用Tukey事后检验和Student t检验，通过单因素ANOVA计算P值。n = 3
图7. 骨水泥抗菌活性的体内评价。(a)体内实验设计示意图。(b)植入手术后1周，琼脂平板法观察到菌落形成。(c)使用琼脂平板法定量分析菌落形成。(d)使用细菌培养法（OD = 600 nm）评价植入手术后1周的抗菌效果。(e)S.在植入手术后1周和2周植入骨水泥后的金黄色葡萄球菌感染的大鼠股骨。(f)放射学评分直方图。(g)植入手术后2周的苏木精-伊红（H&E）染色，（h）革兰氏染色和（i）Masson染色。概览比例尺= 500μm，骨-骨水泥界面比例尺= 200μm。数据表示为平均值±SD。误差线表示标准差。采用Tukey事后检验和Student t检验，通过单因素ANOVA计算P值。n = 4
图8.A）第0、3、5、7和10天用于实时监测普通伤口和糖尿病伤口的代表性照片，图中的pH值通过精密pH试纸获得。B）GelMA/CMCSMAP-GACo水凝胶在不同pH值下的RGB值。C）从智能手机图像计算并通过精确pH试纸检测的糖尿病伤口上的pH值（n = 3）。D）对照组、3 M组、GelMA/CMCSMA水凝胶组和GelMA/CMCSMAP-GACo 0.5水凝胶组在第0、3、5、7、14和21天的糖尿病伤口的代表性照片。E）不同治疗组的伤口愈合程度图像和F）不同治疗组在第0、3、5、7、14和21天的伤口面积比率（n = 3）。G）不同处理组（n = 3）在第14天和第21天处理的伤口组织切片的代表性H&E和Masson染色图像和H）表皮厚度、I）肉芽组织厚度和J）胶原蛋白密度的定量数据
图9骨水泥抗菌能力和骨整合的体内评价。(a)骨水泥种植8周后大鼠股骨的矢状面和三维重建图像。(b)在植入手术后8周进行骨参数分析，包括测量骨体积/总体积（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁数量（Tb. d.N）的情况下。(c)在植入手术后4周进行H&E染色、（d）革兰氏染色和（e）Masson染色。概览比例尺= 500μm;骨水泥界面比例尺= 200μm。数据表示为平均值±SD。误差线表示标准差。采用Tukey事后检验和Student t检验，通过单因素ANOVA计算P值，n = 4
图10.硼硅酸盐生物活性玻璃的机制协同增强了低剂量的植入物抗细菌的能力。
在该研究中，将BSG加入到低剂量GS负载的PMMA骨水泥中，为有效解决细菌感染和促进骨再生提供了一种有前景的实用策略。BSG的加入不仅保持了PMMA上级的机械性能，而且还引入了有益的性能，如BSG降解产生的碱性和离子微环境。与仅含BSG或GS的PMMA骨水泥相比，PMMA骨水泥中BSG和GS的协同作用显著增强了抗菌效力。从机制上讲，BSG的降解损害了细胞壁和膜的完整性，降低了抗氧化组分（过氧化物酶体和类胡萝卜素）的活性，具有良好的抗菌活性。此外，低剂量GS在种植体附近的持续释放通过抑制细菌增值增强了BSG的抗菌作用。此外，BSG与低剂量GS联合应用可促进hBMSCs在体内的存活、增殖和成骨分化。大鼠股骨骨髓感染模型的研究证据表明，将BSG掺入低剂量GS负载的PMMA骨水泥中可增强协同抗菌活性并改善骨整合。该研究强调了BSG在PMMA骨水泥中的应用潜力，作为一种减少抗生素剂量同时增强抗菌活性和骨生成的实用方法。这些发现为解决细菌抗生素耐药性和临床治疗各种感染性骨病提供了希望。
论文链接（DOI）：
https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2024.10.009
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